Cell子刊：AAV-CRISPR纠正DMD模型中肌肉干细胞的突变，终生受益或能实现丨医麦猛爆料

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2019年9月18日/医麦客 eMedClub/--近日，密苏里大学医学院(University of Missouri School of Medicine)的研究人员在一项小鼠研究中表明，基于AAV9的CRISPR基因编辑技术，可以被用来有效地编辑肌肉干细胞（MuSCs）,可能为终生纠正导致杜氏肌营养不良症（DMD）的基因突变提供了一种潜在的方法。相关研究发表在Molecular Therapy期刊上。

该研究的资深作者段东升（Dongsheng Duan）博士是美国密苏里大学讲席教授，主要研究方向是DMD的基因治疗，现任美国 PPMD 和 Solid Biosciences 科学顾问委员会委员，美国基因及细胞治疗协会肌肉骨胳疾病委员会委员。这项研究由他与密苏里大学的其他同事以及来自美国国家转化科学促进中心、约翰霍普金斯大学医学院和杜克大学的研究人员合作。

段东升（Dongsheng Duan）博士（图片来源: 参考来源1）

杜氏肌营养不良症（DMD）是由于在X染色体上编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的基因上出现突变而导致的罕见但具有破坏性的遗传性疾病，如果没有该蛋白，肌肉细胞就会变得脆弱，可导致肌肉萎缩和身体损伤最终死亡。患者的肌无力症状在2-3岁时就很明显，许多儿童因此失去了行走的能力，随着肌肉组织和功能的不断丢失，维持呼吸和心脏功能所必需的肌肉也会逐渐停止工作，患者在30-40岁时便因为呼吸或心力衰竭而面临死亡。

目前，大部分针对DMD的现有疗法只能缓解疾病症状，却不能针对疾病根源，在美国只有一种获批的DMD治疗方法，即Sarepta公司开发的eteplirsen，并且是在没有显著疗效数据的情况下被FDA加速批准，这也反应出对新药的强烈需求。

近年来，AAV递送CRISPR基因编辑系统的应用，使神经肌肉疾病的基因修复策略得到了快速的发展。一系列在各种啮齿动物DMD模型(如mdx和mdx4cv老鼠)和犬模型中的概念验证研究表明,AAV传递Cas9基因和gRNA（CRISPR编辑两个基本组件）,可以修复或删除抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因的突变,恢复抗肌萎缩蛋白（dystrophin）表达，并改善肌肉和心脏功能。

AAV是一个多用途的病毒载体家族，拥有数百个自然存在的和实验室工程的衣壳，适合不同的基因治疗应用。其中，AAV9对DMD基因治疗特别有吸引力，因为它可以在DMD的小动物和大动物模型中导致强效的全身肌肉转导。诺华（Novartis）的基于AAV9病毒载体的基因疗法Zolgensma已于今年5月获FDA批准上市，用于治疗1型脊髓性肌肉萎缩症（SMA）患者；AAV9系统治疗1型SMA的成功，进一步提高了其临床转化的希望。事实上，已经在DMD患者中开展了几项人体试验，以测试全身性的AAV9微小抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因替代疗法。

“研究表明，CRISPR可以用来编辑动物模型中导致肌肉细胞早亡的突变，”段东升（Dongsheng Duan）博士表示，“然而，由于这些经过基因编辑的肌肉细胞会随着时间的推移而损耗，复发是一个主要的担忧。如果我们能够纠正肌肉干细胞的突变，那么从经过编辑的干细胞中再生出来的细胞将不再携带突变。用CRISPR技术一次性治疗肌肉干细胞可导致再生肌肉细胞中抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的持续表达。”

研究人员首先证明了将AAV9同样也能有效转导肌肉干细胞(MuSCs)，并从再生的肌肉中发现了大量经过编辑的细胞。然后，他们测试了用AAV9递送CRISPR/Cas9编辑DMD小鼠模型中的肌肉干细胞，与他们在正常肌肉中发现的相似，病变肌肉中的干细胞也被编辑过。从这些经过编辑的细胞中再生的细胞成功地产生了抗肌萎缩蛋白（dystrophin）。

段东升（Dongsheng Duan）博士认为：“这一发现表明，CRISPR基因编辑可能提供了一种终生纠正DMD和其他潜在肌肉疾病的基因突变的方法。我们的研究表明，CRISPR可以被用来有效地编辑负责肌肉再生的干细胞。治疗负责维持肌肉生长的干细胞的能力，可能为一次性治疗铺平道路，这种一次性治疗可以在患者的一生中提供基因编辑细胞的来源。”

随着更多的研究，研究人员希望这种以干细胞为目标的CRISPR技术有一天可以为患有DMD的儿童带来长期的治疗。

AAV-CRISPR治疗DMD的潜力

多家学术研究机构已经使用基于CRISPR的基因编辑技术，开发治疗DMD的基因编辑疗法。这类疗法目前还处于临床前实验阶段。它的优势在于永久性改变了DMD患者突变基因的结构，因此理论上只需要一次治疗，就可以让患者终身受益。此前，杜克大学（Duke）研究团队在Nature Medicine杂志上发表的题为“Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy”的研究表明，在小鼠模型中，治疗DMD的基因编辑疗法在一年之后仍然可以维持表达抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的效果，显示了AAV-CRISPR在治疗DMD方面的潜力。

而一个极具潜力的领域自然吸引资本的青睐。

Exonics公司在多种小型和大型动物DMD临床前模型中，使用SingleCut CRISPR基因编辑技术使犬模型心肌中的dystrophin恢复至正常表达的92％。此外，Exonics在通过使用AAV-CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗DMD的研究发现，该技术能够识别和纠正那些阻止营养蛋白产生的外显子突变。去年，该公司报告了犬科动物的DMD基因编辑技术。该技术恢复了腿部肌营养不良蛋白正常水平的50％，心脏中超过90％。

今年6月，福泰（Vertex）公司便以2.45亿美元首付、总额可达10亿美元收购了基因编辑公司Exonics，进入DMD和DM1两种罕见肌肉系统疾病领域。

同时，福泰也与另一家基因编辑公司CRISPR Therapeutics达成更深度合作，福泰以1.75亿美元预付款获得CRISPR公司现有和未来知识产权的全球独家权利，其中包括CRISPR-Cas9技术、以及用于DMD的AAV载体和DM1基因编辑产品等。就两家公司的DMD项目计划而言，Vertex负责其所有研发，生产和商业化部分。该合作总额也达10亿美元。

结 语

 传统的针对DMD的基因治疗方法主要是通过病毒载体将功能性基因拷贝，使其表达产生抗肌萎缩蛋白，以达到治疗DMD的目的。而基于CRISPR基因编辑技术或能永久性改变DMD突变基因，达到治疗效果。而段东升博士等人的这项在肌肉干细胞上实现AAV-CRISPR基因编辑的发现使得实现DMD患者实现一次治疗终身受益又近了一步。

参考来源：

1.https://medicalxpress.com/news/2019-09-gene-enables-mutation-muscle-stem.html

2.DOI: 10.1016/j.ymthe.2019.06.012

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