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2019年9月16日/医麦客 eMedClub/--CRISPR/Cas9系统作为当前最热门的基因编辑工具，可以介导多功能和高精度的基因组修饰，实现对肿瘤、遗传性疾病和感染性疾病等多种重大疾病的治疗。CRISPR/Cas9在细胞内发挥基因编辑作用的形式分别是Cas9蛋白和gRNA, 而Cas9进入细胞的形式可以有3种: DNA, RNA或蛋白; gRNA进入细胞的形式有2种: DNA或RNA。然而，由于缺乏合适的递送系统，限制了CRISPR/Cas9技术在临床上的应用。目前基于CRISPR/Cas9的治疗技术主要是通过靶向递送来实现的，CRISPR/Cas9系统的递送方式主要包括：物理方法、病毒载体和非病毒载体。其中物理递送方法比较常用的是电穿孔法，难以在体内使用；病毒载体是目前使用最广泛的一种方法，但其存在着潜在的安全性和有效性问题，例如对宿主细胞可能产生致癌、致突变的风险，另外病毒载体负载能力有限(比如腺相关病毒只能负载不大于4.7 kb的DNA序列)。因此，目前许多研究聚焦在非病毒载体上，主要包括聚合物、脂质体、纳米材料，以及新兴的外泌体等。如何安全有效地将CRISPR/Cas9系统递送至生物体内并发挥其基因编辑功能，仍面临着许多机遇和挑战。
使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑通常有三种策略，第一种也是最简便的方法是将CRISPR/Cas9系统所需的Cas9蛋白和sgRNA编码进同一个质粒DNA (plasmid DNA, pDNA)载体中, 从而避免不同组分的多次转染.。第二种策略是递送Cas9蛋白的信使RNA (messager RNA, mRNA)和sgRNA。第三种策略是直接使用Cas9蛋白和sgRNA形成核糖核蛋白(Ribo-nucleoprotein, RNP)进行基因组编辑。每种方法都有其优缺点, 并面临着独特的挑战。
▲ CRISPR/Cas9系统的递送形式（图片来源于参考来源5）
基于pDNA（将CRISPR/Cas9系统所需的Cas9蛋白和sgRNA编码进同一个质粒DNA (plasmid DNA, pDNA)载体中）的CRISPR/Cas9的系统, 由于操作简单且成本低而成为极具吸引人的一种方法，然而, 编码后pDNA的尺寸过大会显著增加CRISPR/Cas9系统递送和表达的难度；pDNA进入细胞核后的转录过程会降低基因编辑的效率并且还会导致治疗过程的延迟；此外, 基于pDNA的表达通常会导致Cas9蛋白长时间存在于细胞中, 这可能会导致更高的脱靶效应和强烈的免疫应答。
阳离子聚合物通过静电作用与pDNA进行络合形成复合物而保护pDNA免于核酸酶降解。其次, 通过对阳离子聚合物与pDNA的比例进行精细调控, 实现了对负载pDNA的纳米粒子的粒径及表面电荷进行精确控制, 从而使细胞对pDNA摄取的最大化, 并促进Cas9蛋白及sgRNA的表达。然而Cas9蛋白的大分子量使得编码CRISPR/Cas9系统的pDNA尺寸较大, 所以很难对各方面同时进行优化。高分子聚合物由短链重复单元聚合而形成, 由于重复单元的结构高度可控, 可以根据所载物质的响应性需求进行精确的设计, 这种在结构上无可比拟的多样性和功能上的全面性, 赋予了高分子聚合物在递送pDNA时的无限可能。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)、壳聚糖和聚(L-赖氨酸)是被研究最透彻也是目前应用最广泛的三种阳离子聚合物。
Cas9蛋白的mRNA可以比较容易地通过体外转录获得，使用Cas9蛋白的mRNA的优势在于可以较快速地启动基因编辑, 因为mRNA不需要再进入细胞核进行转录，也因此能够对mRNA的剂量进行精确控制, 且能显著性降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。mRNA的稳定性相对较差，为了实现对mRNA高效且精准的递送, 在载体的设计方面必须保护mRNA免受胞外核酸酶的降解。
多种市售脂质复合物已经大量用于体外和体内转染，已有研究利用脂质体作为载体递送Cas9蛋白的mRNA, 在细胞水平上和小鼠体内实现对哺乳动物基因组的精确编辑，但脂质体较高的细胞毒性问题是其优化升级的主要方向。另外常规pDNA载体足以达到mRNA递送的要求，近年来，聚合物类载体, 如壳聚糖、PEI及聚(β-氨基酯)均已从pDNA的载体适配到mRNA的递送体系上。
对于CRISPR/Cas9系统来说, 最高效的方式就是跳过pDNA或mRNA在细胞内对Cas9蛋白及sgRNA的表达, 而且对Cas9蛋白和sgRNA直接进行递送，可以最大程度地降低脱靶效应。将Cas9蛋白直接进行递送并实现基因组的高效编辑必不可少的两个条件分别是：载体协助Cas9蛋白成功实现细胞内递送以及高效的溶酶体逃逸。负载Cas9蛋白的纳米递送系统可协助Cas9蛋白进入目标细胞, 在对靶点进行切割后可立即通过内源性蛋白酶进行快速降解以实现更高的基因编辑效率和更低的脱靶效应。
通常, 蛋白质主要有三种递送方式：蛋白质与载体的直接缀合、蛋白质与载体基于电荷或亲疏水作用的物理吸附以及基于乳液分散所形成的蛋白质纳米胶囊。常用于递送蛋白质的纳米载体包括胶体纳米颗粒(如脂质体和固体脂质纳米颗粒)、聚合物纳米材料(如聚合物膜、纳米胶囊以及胶束)、无机纳米载体(如碳纳米管、量子点、介孔二氧化硅、磁性纳米颗粒、金纳米颗粒、金属有机框架、黑磷纳米片)等。目前大部分基于Cas9蛋白的递送体系都是以RNP的形式进行递送，现有的蛋白质递送平台将为Cas9蛋白和RNP递送提供巨大潜力。
▲ CRISPR/Cas9的非病毒递送载体（图片来源于参考来源5）
美国威斯康辛大学麦迪逊分校的宫绍琴教授团队致力于设计和建造用于靶向治疗的纳米级递送系统，提供各种有效载荷，包括小分子药物、蛋白质、DNA、RNA和基于CRISPR的基因组编辑剂等。他们开发的可定制的高效纳米平台，为在体和离体应用提供Cas9 RNP复合物。该研究团队通过原位聚合合成，设计了一种直径约25nm的纳米胶囊(NC)，其外壳涂有薄的谷胱甘肽(GSH) - 可切割的共价交联聚合物，用来包裹Cas9核酸酶和sgRNA之间的预装配核糖核蛋白(RNP)复合物。这种可定制合成纳米胶囊，实现了CRISPR组分的受控化学计量，并避免体内潜在的安全性问题。相关研究结果于2019年9月9日发表在Nature Nanotechnology上。团队下一步将优化正在研究的纳米胶囊，以便有效地在大脑和眼睛进行编辑。
Nature子刊: 华人科学家开发递送CRISPR-Cas9的纳米胶囊，有望实现更安全可控的治疗丨医麦猛爆料
美国波士顿儿童医院
2019年8月26日，美国波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)的研究人员首次成功使用靶向的CRISPR基因编辑技术来阻止TNBC（三阴性乳腺癌，所有乳腺癌中死亡率最高的）肿瘤在体内的生长（通过注射到活的肿瘤小鼠体内）。相关研究发表在美国国家科学院院刊(PNAS)上，主要报道了一种用于肿瘤基因编辑的非阳离子、可变形、靶向肿瘤的纳米脂凝胶系统(tNLG)的合成和应用。
该研究中，CRISPR系统被封装在纳米脂质凝胶颗粒中，这种载体由无毒脂肪分子和水凝胶组成，无毒、具有良好的柔性和弹性，可与靶向细胞的细胞膜融合，并有效递送携带的DNA序列。另外，凝胶表面偶联了特定的抗体，可特异性识别TNBC细胞的靶点ICAM-1蛋白，从而将CRISPR系统引导至肿瘤部位，敲除乳腺癌促进基因之一Lipocalin-2（LCN2），从而达到治疗的目的。结果显示，肿瘤细胞组织的基因敲除效率达到81%，肿瘤生长速率降低了77%，与此同时，正常的细胞组织没有受到明显的影响。
2019年6月19日，Tufts University与中国科学院(Chinese Academy of Sciences)合作的一项研究发表在《Advanced Materials》杂志上。该研究中描述了一种可生物降解的合成脂质纳米颗粒（BAMEA‐O16B），可导致CRISPR/Cas9基因编辑方法在肝脏中的传递机制得到显著改善。
这种脂质纳米颗粒封装了编码Cas9的信使RNA (mRNA)和sgRNA，由可生物再生的连接剂制成的合成脂质形成内容物的封装墙，在进入细胞后，无论是在体外还是在体内，连接物被破坏、纳米颗粒解体、内容物释放，随后细胞的蛋白质生成机制开始通过mRNA模板生成Cas9活性酶，完成基因编辑工具。BAMEA‐O16B最快可在24小时后便释放mRNA以响应细胞内还原环境进行基因组编辑，并以相当高的效率精确地改变细胞的遗传密码。
而关于脂质纳米粒子递送技术，不得不提的就是Intellia Therapeutics和诺华。2018年2月27日，Intellia Therapeutics宣布发表了名为《CRISPR / Cas9脂质纳米粒子的单一管理实现了强大和持久的体内基因组编辑》的临床前数据的细胞报告，展示了在使用脂质纳米粒子（LNP）递送技术后进行CRISPR / Cas9基因编辑所得到的安全有效的数据结果。
2018年12月，Intellia公司与诺华合作，把诺华专有的脂质纳米粒子递送技术（LNP）扩展到所有在研项目中，用于递送CRISPR/Cas9组分。目前，该公司推进最快的在体基因编辑疗法针对致耐受性器官(肝脏)的疾病——转甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR)，预计将于2019年底提交IND申请。新型纳米颗粒以更高的效率将CRISPR基因编辑工具送入细胞丨医麦猛爆料
韩国东国大学（Dongguk University ）
2019年3月11日，Nature Neuroscience 杂志发表了一项关于阿尔兹海默病的研究进展，为治愈阿尔兹海默病带来新的曙光。该研究的通讯作者为韩国东国大学（Dongguk University ）的Jongpil Kim。
阿尔茨海默病（AD），俗称老年痴呆症，是最常见的神经退行性疾病，β淀粉样蛋白（Aβ）积累是其特征之一。由于β-分泌酶1（Bace1）是产生β淀粉样蛋白（Aβ）所必需的，因此靶向Bace1是阿尔茨海默病治疗的潜在治疗策略。然而实现在不分裂的神经元细胞中的体内基因靶向编辑，仍然是基于CRISPR/Cas9的基因编辑治疗的一个巨大挑战。
该研究通过一种CRISPR/Cas9-纳米复合物，成功在体内神经元中编辑了Bace1基因，减轻了阿尔茨海默病小鼠模型的β淀粉样蛋白（Aβ）相关病理和认知缺陷且未发现脱靶效应。使用非病毒载体的Cas9-纳米复合物进行体内基因编辑的研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在神经退行性疾病中的潜在应用。
进一步实现基于非病毒载体的CRISPR/Cas9系统的可控性
2019年4月3日，南京大学现代工程与应用科学学院相关团队在Science Advances发表文章"Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform"，该团队利用光敏分子、上转换纳米颗粒（UCNPs）和CRISPR-Cas9，设计出了一种可以远程操纵的基因编辑技术。文章通讯作者：宋玉君教授（南京大学）、林友辉副教授（厦门大学）、王玉珍副研究员（南京工业大学）。
近年来，一些非病毒载体被开发并被用于CRISPR-Cas9体系中，但基于非病毒载体实现可控的基因编辑的研究鲜有报道。宋玉君教授课题组致力于开发高效的、基于非病毒载体的CRISPR-Cas9系统，希望能在空间和时间上实现对体内基因组精确可控的编辑，为此他们设计了一种基于上转换纳米粒子（UCNPs）的CRISPR/Cas9递送系统，用于癌症治疗。具体来说，该系统利用光敏分子将CRISPR-Cas9体系共价“锁”在UCNPs上，并且用一层高分子材料PEI包被，该复合纳米粒子被称为“UCNPs-Cas9@PEI”，它可以通过胞吞作用途径被细胞有效内吞。然后在近红外光照射下，UCNPs可以吸收近红外光将其转换成高能紫外光，发射出的紫外光解开Cas9蛋白和UCNPs之间的“锁”，从而实现CRISPR-Cas9的按需可控释放，从而进入细胞核实现基因剪切。该技术不仅可以控制CRISPR/Cas9的释放时间，还由于红外光的强组织穿透性，有望在深层组织中实现CRISPR-Cas9基因编辑的精确调控。
外泌体（EV）作为细胞间通讯的一种自然方式，具有生物相容性，在适当的时候具有免疫惰性，并且可以有效地到达目标，越来越多的被作为小分子疗法、蛋白质、RNA、DNA和潜在的新CRISPR技术的递送载体。例如，肿瘤来源的外泌体在体外通过电穿孔的方式包装CRISPR / Cas9表达质粒，用作CRISPR / Cas9系统的载体。此外，一种脂质体杂交外泌体所得到的杂合纳米粒子可以有效地将大的CRISPR / Cas9表达质粒包封并递送到靶细胞中。同样，递送质粒存在非特异性编辑的风险，递送Cas9蛋白 /gRNA复合物或更具安全性。
2019年7月4日，来自北京大学医学部基础医学院鲁凤民、王杰课题组的研究人员发现，表达CRISPR/Cas9的细胞可以分泌携带功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌体，这些外泌体可以向其他组织细胞输送基因编辑活性。该研究证明了内源外泌体作为功能性gRNA和Cas9蛋白的安全有效递送载体的潜力。外泌体的这一作用虽然可以避免病毒载体系统本身带来的副作用，但由于外泌体的广泛传递性也为这一系统的应用带来了新的风险。这项研究发表于Small杂志上。
2018年香港城市大学Jiahai Shi教授和Minh Le教授等人发表在《Nature Communications》上的一篇名为“Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles”的文章。描述并验证了一种新的策略，该策略可产生大量由RBC衍生的EV（RBCEV），并证明RBCEVs介导的RNA药物传递在白血病和乳腺癌细胞中表现出高效的microRNA敲低和CRISPR Cas9基因编辑敲除功能，并且不产生任何细胞毒性。
由于目前生产EV的细胞来源在水平基因转移的有效性和安全性方面受到限制，这一发现或将解决外泌体作为基因治疗递送系统的细胞来源问题。新锐生物公司Carmine Therapeutics基于这项红细胞外泌体递送技术的REGENT平台是一个专有的RBCEV分离、工程化和制造平台，正在血液学、肿瘤学和免疫学领域开发下一代基因疗法。
应对外泌体作为基因治疗递送系统的细胞来源问题，这家公司的变革性技术值得期待丨医麦黑科技
使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑所面临的主要挑战是将该系统有效地递送至目的细胞中。非病毒载体在CRISPR/Cas9系统的体内应用中将起到关键作用。在今年8月公布的国家自然科学基金申请项目评审结果中也不乏CRISPR/Cas9系统递送系统的研究：
负责人：Anna Czarna 申请单位：华南理工大学 研究类型：面上项目 项目批准号：81971723 批准年度：2019
负责人：于博 申请单位：南方医科大学 研究类型：面上项目 项目批准号：81974323 批准年度：2019
与编码Cas9蛋白的pDNA或mRNA不同, 对Cas9蛋白/sgRNA直接进行递送可以避免细胞核对CRISPR/Cas9系统翻译过程中的非预期整合、最小化脱靶效应以实现对目标基因的高效编辑。然而负载Cas9蛋白的纳米粒子在保持蛋白生物活性的同时很难保护其免受血液中胰酶降解和单核系统清除。与pDNA或mRNA相比, 可供选择的蛋白质载体少之又少, 因此发展能够克服Cas9蛋白所固有问题的非病毒载体将极可能把CRISPR/Cas9技术的应用推向另一高度。
1.外泌体之家：北京大学医学部：是好是坏？内源分泌的外泌体可以携带功能性gRNA和Cas9蛋白5.刘琦, 张展展, 刘阳. 非病毒CRISPR/Cas9系统载体的研究进展[J]. 中国科学:化学, 2019, 49(05):100-113.
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