Cellectis又出新成果，经TALEN基因编辑的CAR-T微分泌IL-12 ，重塑肿瘤微环境｜医麦黑科技
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2019年11月17日/医麦客 eMedClub/--近日，致力于开发基于同种异体基因编辑的CAR-T细胞(UCART)的法国生物科技公司Cellectis发表了一项概念验证研究，详细描述了其新的“smart” CAR-T治疗方法，这种细胞能够通过微分泌治疗蛋白对肿瘤进行感知和反应，从而提高其对抗癌细胞的能力，有可能为下一代严格受控的、高度活跃且可能更安全的CAR-T铺平道路。
这项研究于11月13日发表在Nature Communications上。Cellectis的研究人员通过使用该公司专有的TALEN® 技术，重新利用T细胞活化途径的三个主要参与者TCRα、CD25和PD1基因，从而使得CAR-T细胞能够通过以肿瘤和时间依赖性方式微量分泌促炎细胞因子白介素12(IL-12)重塑肿瘤微环境。研究中，与4只未经治疗的小鼠相比，细胞疗法显著提高了7只淋巴瘤小鼠的存活率。
诸如CAR-T等T细胞疗法为治疗广泛的恶性肿瘤带来了巨大的希望。然而，这些疗法面临多重挑战，包括肿瘤的可及性、肿瘤依赖性抑制信号以及与T细胞敌对的微环境。为了克服这些障碍，CAR-T细胞被改造为去除抑制性受体、表达共刺激分子和趋化因子受体，或分泌免疫刺激因子，如检查点抑制剂或细胞因子。
尤其是能分泌细胞因子的“装甲”CAR-T细胞，这是一种非常有前途的改善CAR-T细胞功能的策略。据报道，当通过慢病毒或γ逆转录病毒载体转导整合到T细胞基因组时，重组IL-12P70、IL-15和 IL-18可增加CAR-T细胞抗肿瘤活性，防止CAR-T细胞耗竭，重塑肿瘤微环境，并招募抗肿瘤反应所必需的固有免疫细胞。然而，由于这些免疫刺激剂是高效的，它们可能有副作用。当CAR-T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)分泌时，由于对其分泌的控制欠佳和循环中释放的大量因子，它们可产生不良的临床前和临床事件。因此，能够严格控制工程化T细胞产生、分泌或递呈外源目的蛋白的新工程策略将对开发下一代基于T细胞的疗法有重要意义。
免疫途径提供了一系列严格调控的基因，这些基因可以重新用于以高度受控的方式表达有效的功能。例如，T细胞通过T细胞受体 (TCR) 参与的激活触发了一个多步骤的信号传导过程，导致转录因子的激活，包括活化T细胞核因子(NFAT)，它精确地协调了基因表达和随后的蛋白质翻译。其中一些基因(包括IL-2、CD69和IL2Rα)被快速诱导以促进T细胞增殖、分化和活化，而另一些基因(包括PDCD1、LAG3 和 FASLG)被诱导后作为免疫应答的“刹车”。
由于转录和翻译后调控，这些基因的协同诱导遵循精确的动力学和定量模式，微调T细胞的功能输出。因此，通过重新利用内源性基因表达定制这些功能输出代表了一种有吸引力的手段，用于生成能够以定制的、高度调节的和抗原特异性的方式感知并对其环境做出反应的smart CAR-T细胞。
更聪明的CAR-T
Cellectis细胞工程和过继CAR-T细胞免疫疗法创新团队负责人Julien Valton博士和他的同事们在周三发表在Nature Communications上的一项研究中详细描述了如何“重新利用内源性免疫通路来定制和控制CAR-T细胞功能”。
研究人员通过使用了Cellectis公司的TALEN技术与重组腺相关病毒6(AAV6)把CAR和IL-12P70分别地插入TCR (TRACCAR)和IL2Rα或PDCD1基因座。
▲ 基因编辑工程示意图（图片来源：Nature Communications）
这种多重基因再利用过程促使CAR的表达和IL-12P70的条件性分泌。IL-12P70的分泌是短暂的，依赖于肿瘤的参与，遵循T细胞活化时观察到的CD25和PD1表达的严格调控模式。IL-12P70可促进TRACCAR T细胞的聚集，并显著提高其体内外抗肿瘤活性。此外，IL-12P70在PDCD1位点的靶向整合伴随着失活PD1，PD1是抑制T细胞功能的主要检查点之一。
研究人员在Raji淋巴瘤小鼠模型中评估了TRACCAR T细胞的体内抗肿瘤活性。作为概念验证，他们把重点放在PDCD1位点而不是IL2Rα位点的工程上，因为 (1) PD1的同时失活和IL-12的分泌代表了TRACCAR T细胞功能的双重优势，并且具有很高的临床应用潜力；(2) 研究中，PDCD1位点支持IL-12P70的分泌量小于IL2Rα的分泌量。因此，检测两种方法中较为温和的方法是否已经在体内具有抗肿瘤获益具有特殊意义。
与早期结果一致，研究人员发现TRACCAR_ΔPD1IL12 能更好地控制肿瘤生长，并显著延长小鼠生存期，超过TRACCAR 或 TRACCAR_ΔPD1。这种抗肿瘤活性的改善与前45天内TRACCAR_ΔPD1IL12组的体重减轻无关，除了一只小鼠在肿瘤注射后14天死亡，没有任何肿瘤复发的迹象。
▲ IL-12P70的条件性分泌增加了TRACCAR T细胞的体内抗肿瘤活性（图片来源：Nature Communications）
总之，结果表明，IL-12P70的肿瘤依赖性和调节表达增加了TRACCAR T细胞的抗肿瘤活性及其持久性，并具有IL-12P70已知的生物学和治疗获益。
Valton表示：“因为我们的工程策略是模块化的，它也可以被用来分泌无数不同临床级别的治疗蛋白——其他免疫刺激剂包括 IL-15、IL-18、PD1检查点抑制剂等，以适应不同条件下的环境和用于不同的适应症来对抗癌症。”
这种概念验证也为众多治疗组合的探索铺平了道路，并能将更聪明、更安全、更有效的治疗方法推向前沿。
领先的通用CAR-T公司
法国Cellectis公司，其基于TALEN基因编辑技术的细胞疗法是现在全球临床进展最快的通用CAR-T(UCART)。目前，公司在研的通用型CAR-T产品包括四个靶点，分别为CD19、CD123、CD22以及CS1。其中，最成熟的UCART19经过辉瑞、施维雅(Servier)等多家公司授权，美国市场的开发和商业化已转于Allogene Therapeutics负责，Servier负责全球其他国家和地区的市场。
Cellectis的TALEN技术是基于一类来源于转录激活因子样效应物 (transcription activator-like effectors，TALEs)的蛋白，高度特异性的DNA结合蛋白具有33或34个氨基酸重复序列的阵列。除第12和13位氨基酸的重复可变双残基(RVD)外，每个重复高度保守。RVD决定了TALE将结合的DNA序列。由此产生的TALE重复序列和相应的 DNA 序列之间的一对一对应，旨在使组装重复序列识别新DNA序列的过程简单明了。
TALE可以与来自DNA核酸酶FokI的催化结构域融合，生成转录激活因子样效应物核酸酶或TALEN构建体，旨在结合高特异性和活性，有效地产生工程化的序列特异性核酸酶，仅在预选的位点结合和切割DNA序列。TALEN产品是通过将核酸酶的DNA切割结构域融合到TALE结构域上而设计的，TALE结构域可以被定制特异性识别独特的DNA序列。根据Cellectis的说法，这些融合蛋白可以作为基因编辑应用程序的“DNA剪刀”，使研究人员能够在活细胞中进行有针对性的基因组修改，如序列插入、删除、修复和替换。
Cellectis并不是唯一一家开发现成CAR-T细胞疗法的公司。
比利时生物技术公司Celyad最近发表了有史以来首例针对结直肠癌患者的CAR-T细胞疗法的临床结果。结果显示，到目前为止，在接受Celyad CAR-T细胞治疗的12名患者中，有6名肿瘤缩小。该疗法也没有显示出导致移植物抗宿主病的证据。
参考出处：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-13088-3
https://www.genengnews.com/news/cellectis-details-proof-of-concept-for-smart-car-t-cells/
https://www.labiotech.eu/medical/cellectis-car-t-therapy-cancer/
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