博雅辑因β-地贫CRISPR基因编辑疗法亮相ASH，首次发布临床级规模化生产及临床前研究的安全性和有效性数据丨医麦猛爆料
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2019年11月7日/医麦客 eMedClub/--博雅辑因宣布将于2019年12月7-10日第61届美国血液学年会（ASH）上首次发布其β-地中海贫血基因疗法项目（ET-01）的部分数据。
“ET-01项目的这些研究进展让我们感到振奋。我们计划近期与中国监管部门沟通，期望尽快将此项技术推上临床研究，为国内急需的β-地中海贫血重症患者带来可能的新的治疗。”博雅辑因CEO魏东博士对此表示。
地贫 — 我国南方为高发地区
地贫是全球分布最广、累及人群最多的一种单基因遗传病，主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国。
我国长江以南的广大区域地贫高发，其中尤以广西、广东和海南三省(区)为甚，其他还有云南、贵州、福建、江西、湖南、四川、重庆、香港、台湾等省(区、市)，发病率达10%~14%。我国北方则主要见于古“丝绸之路”的陕西、甘肃、新疆一些地区，推测与东西方人群交流有关。近年来随着经济社会发展和改革开放，人口流动频繁，湖北、江苏、浙江、上海和北京等省(市)也出现少量病例。
β-地中海贫血症是由位于第11号染色体的β-珠蛋白(β-globin)基因决定簇发生遗传性点突变或缺失，β-珠蛋白合成完全或部分受抑制，导致α/β链比例失衡，从而产生一系列症状和体征的遗传性溶血性疾病。流行病学数据显示，在某些β地中海贫血患者中，胎儿血红蛋白（HbF）升高可减轻临床症状。
据统计，每年约有6万名婴儿出生时患有严重的输血依赖性β地中海贫血(TDT)，全球有超过20万名患者。
β地贫的治疗现况
目前，地贫的常规治疗是规律输血和充分除铁治疗。许多TDT患者由于潜在的疾病和铁超负荷而经历严重的并发症和器官损伤。另外，传统的终身输血排铁治疗一生约需花费480万元，是绝大多数家庭不可承受的沉重负担。
▲ 图片来源：Medical News Today
应用化学药物可增加γ基因表达或减少α基因表达，以改善β-地贫的症状，已用于临床的药物有羟基脲、5 -氮杂胞苷、阿糖胞苷、马利兰、异烟肼等，目前正在探索之中。
造血干细胞移植(HSCT)治疗也是目前证明能根治地贫的方法，但由于配型难以及移植排斥等问题，只有一部分患者能从中获益。如果极其幸运能够找到移植骨髓，手术成本约为40万元。HSCT的并发症包括治疗相关死亡率、移植物衰竭、移植物抗宿主病(GvHD)和机会性感染的风险，特别是在接受非同胞匹配的患者中。
近年来，基因疗法的出现给患者带来了希望，其最大的优势在于不需要捐赠，不需要异体移植，而且一次治疗可能导致永久性的“治愈”，有望取代目前并不完美的治疗方案。
新的希望——基因治疗
bluebird bio的Zynteglo是全球首个获批的TDT基因疗法，用于治疗12岁及以上的非β0/β0基因型输血依赖性β-地中海贫血患者。Zynteglo的活性物质是自体CD34+细胞富集的群体，通过BB305慢病毒载体将修饰的β-珠蛋白基因的功能性拷贝(βA-T87Q-globin)添加到患者的造血干细胞(HSC)中。将以1.2-20 x 10^6细胞/ml分散液的形式提供输液。
Zynteglo是基于慢病毒整合的范例，类似的，意大利米兰IRCCS San Raffaele医院使用了GLOBE慢病毒载体转导自体HSC的策略，并正在进行I/II期试验。这也是第一个同时应用于成人和儿科患者的β-地中海贫血基因治疗临床试验(NCT02453477)。
然而，人们对基于慢病毒整合的方法也存在担忧。慢病毒整合转基因到宿主基因组的能力使产物稳定和长期的表达，但和γ-逆转录病毒一样，仍存在潜在插入突变的安全性问题。常规慢病毒基因组整合过程不可控，伴有致癌风险此外，这种方法需要大量病毒，意味着潜在巨额的花费。
此外，还有一种基于CRISPR的基因编辑疗法治疗β-地中海贫血症的策略，如CRISPR Therapeutics/Vertex在研基因疗法CTX001就是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，正在I/II期临床试验中用于治疗TDT；博雅辑因的β地贫基因疗法ET-01同样采用CRISPR/Cas9技术。
CRISPR基因编辑疗法的安全性挑战
但是由于CRISPR存在不同程度的脱靶效应（OTE）问题，使得基于CRISPR的疗法的开发成本和成功率都不那么令人满意，也让人担忧其的安全性。
9月11日，北京大学生命科学学院邓宏魁教授、307医院的陈虎教授以及北京佑安医院吴昊教授研究组合作在《新英格兰医学杂志》（The New England Journal of Medicine）上发表文章《CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia》，报道了首例利用CRISPR-Cas9基因标记技术在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中编辑CCR5基因并成功移植到罹患HIV和急性淋巴细胞白血病的患者案例，移植治疗使病人的急性淋巴白血病得到完全缓解，携带CCR5突变的供体细胞能够在受体体内长期存活达19个月，未出现明显的编辑后副反应。
中国科技教育司在其《中国卫生领域国家科技重大专项进展与动态》中对此表示这项研究将基础研究快速转化成为了I期临床试验，且未引发伦理上的担忧，对于推动全球范围内基于CRISPR基因编辑手段用于临床治疗具有重大意义。
《Nature Medicine》也对该研究成果发表了评论，肯定了该研究成果对验证CRISPR基因编辑治疗可行性及安全性的重大意义，并表示：该临床实验结果减弱了人们对CRISPR基因编辑治疗安全性的担忧。费城宾夕法尼亚大学的免疫学家Carl June希望这项新研究能够鼓励科学家和创新公司对其他疾病进行CRISPR基因编辑治疗。
β地贫基因疗法的新进展
博雅辑因将在第61届美国血液学年会（ASH）上公布其β-地中海贫血基因疗法项目（ET-01）的部分数据。此次展示将重点介绍ET-01临床级规模化生产，以及支持其后临床试验的体外和体内的临床前研究的安全性和有效性数据。该数据表明在ET-01中，供者自体的CD34+造血干细胞的特定DNA靶点被CRISPR/CAS9高效率和高精准度地修饰，在体外分化后的红细胞中胎儿血红蛋白（HbF）水平得到显著提高，以及在临床前研究中的安全性。
原理：BCL11A是已知在抑制γ-珠蛋白表达中起关键作用的主要转录因子之一，基于此，ET-01通过CRISPR / Cas9编辑自体CD34 +细胞破坏BCL11A基因的红系增强子，并重新激活沉默的γ-珠蛋白，来达到治疗β地中海贫血的目的。该公司公布的数据显示，在ET-01中，BCL11A增强子可以以高精度和高效率进行编辑，从而导致HbF水平高于潜在的治疗阈值。
为了破坏BCL11A增强子，研究人员使用电穿孔将Cas9 mRNA和合成sgRNA从健康供体和β0/β0供体传递到CD34 + HSC中。插入缺失频率（即基因编辑效率）约为80％，对于两种类型的供体都是一致的。ET-01与未经编辑的CD34 + HSC之间的体外红系分化效率基本相同。与未经编辑的CD34 + HSC相比，ET-01中的HbF +细胞和γ-珠蛋白mRNA水平均显著升高。重要的是，在由β0/β0供体的细胞制成的ET-01中，γ-球蛋白的水平加上β-球蛋白的水平达到了阈值以上，具有潜在的临床意义。同时，来自菌落形成单位测定的数据表明，菌落类型和菌落总数在ET-01与未经编辑的CD34 + HSC之间具有可比性，这表明在ET-01中菌落形成能力没有受到显著影响。
▲破坏BCL11A增强剂以诱导健康和β0/β0供体的CD34 + HSPC上HbF和y-珠蛋白的表达（图片来源：ash.confex）
为了评估ET-01中使用的基因编辑方法的特异性，该研究团队通过靶向PCR扩增和下一代测序分析，对42个潜在脱靶位点进行了深入研究。数据显示在这些位点没有明显的脱靶事件，表明对ET-01的脱靶效应最小。
此外，为了评估ET-01在体内的植入潜力，研究团队将ET-01和未经编辑的CD34 + HSC移植到免疫缺陷的NPG小鼠中。两种类型的细胞均在所有小鼠中产生相似的快速有效移植，并在多个造血和免疫器官中对人类细胞进行相似的多谱系重建。重要的是，在移植4个月后和第二次移植后，NPG小鼠中ET-01的Indels效率维持在相似的水平。这些发现表明，ET-01保留了体内长期的造血重建和分化能力。在这些体内研究中未观察到致瘤性。
整个生产过程和所有批次中均实现了高细胞活力、CD34 +纯度和Indels频率。体外红细胞分化效率、HbF +细胞和γ-珠蛋白mRNA水平与在研究规模下观察到的相似。这都表明了ET-01的生产上限受制于获得的起始原料的数量，而不是实际的工艺能力。
结语
在中国，地中海贫血病基因携带者高达3000万人，仅重型地贫患者就达5万例。与西方国家比较，这些病患寿命很短， 绝大部分生命止于20岁之前，对家庭造成了巨大的精神痛苦和经济困难。
随着博雅辑因最新公布的数据，我们有理由相信ET-01在不久的将来，会给带中国地贫患者新的希望。
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参考资料：
1.https://ash.confex.com/ash/2019/webprogram/Paper126499.html
2.http://www.nhc.gov.cn/qjjys/s7937/201910/fb568d68813f49e4916f8b60b1081a44.shtml
3.https://mp.weixin.qq.com/s/lPAJo1PgLnkqvTDq9GN2_Q
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