一文详述：如何克服CAR-T治疗过程中的脱靶效应丨医麦新观察

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2020年1月29日/医麦客 eMedClub/--目前，与CAR-T细胞相关的主要挑战包括严重的毒性，肿瘤内的限制转运、浸润和激活，相对欠缺的体内持久性，抗原逃逸和肿瘤异质性，以及制造问题。CAR设计超越传统结构的进展将是解决这些限制并将CAR-T细胞的使用扩展到更广泛的恶性肿瘤中所必需的。

CAR-T细胞治疗的主要毒性大致可分为两类：

（1）与T细胞活化以及随后高水平细胞因子的系统性释放相关的毒性；

（2）CAR与靶抗原之间的特异性相互作用所产生的毒性，这些抗原由非恶性细胞表达，称为（on-target/off-tumor）脱靶效应。

之前我们已经讨论过通过CAR的设计解决系统性细胞因子毒性的策略。下面，我们将目光放到CAR-T治疗脱靶效应的应对策略。

CAR-T治疗的脱靶效应

在我们人体中存在着很多不同的细胞，虽然功能各异，但存在着很多相似的地方。肿瘤细胞也不例外，由于肿瘤细胞与正常细胞有很多共同点，导致我们很难正确的区分它们，如何找到只属于肿瘤细胞的特异性抗原是科学家一直努力的目标。而CAR-T疗法在攻击肿瘤细胞时会出现难以控制的攻击其他正常细胞，就这是我们所说的“脱靶效应”。

在一项以碳酸酐酶IX (CAIX)为靶点的CAR-T细胞产品的临床试验中，肾癌患者中多个患者出现了肝酶异常。这些不良反应是由CAR-T细胞浸润到表达CAIX的胆管上皮引起的，随后患者通过使用一种抗CAIX单克隆抗体得以预防，这为脱靶毒性提供了强有力的证据。

更令人担忧的是，一名接受HER2 CAR-T细胞治疗转移性结肠癌的患者在接受细胞输注15分钟后出现呼吸窘迫和肺水肿，进而发展为多器官衰竭和死亡。据推测，这种毒性的机制可能是通过CAR-T细胞识别非恶性肺组织中的HER2，从而引发了系统性的细胞因子风暴。

而考虑到这些研究中使用的共刺激域、调节方案、细胞因子给药和CAR-T细胞剂量的差异，而且其中一些毒性很难与一般细胞因子相关的毒性区别开来，因此有时很难确定临床并发症是否反映了“脱靶效应”。尽管如此，旨在限制脱靶效应毒性的技术可以为产生更多临床有效的CAR-T疗法提供可能，目前有许多方法正在开发中。

克服策略

CAR-T细胞的典型设计在于靶向肿瘤相关抗原(TAAs)，然而，这些抗原在健康组织上的表达可能导致CAR-T细胞介导的脱靶效应毒性。旨在克服这一问题的工程策略包括通过各种方式来增强CAR-T细胞的肿瘤特异性机制。

如果无法识别肿瘤特异性抗原，另一种靶向癌细胞并避免对表达目标抗原的非恶性组织的毒性作用的策略依赖于肿瘤和非恶性组织间抗原表达水平的差异，这种方法称为亲和调节。与非恶性细胞相比，在肿瘤细胞上表达水平更高的抗原可能被低亲和力的scFv CAR靶向，从而确保只有抗原密度高的肿瘤细胞才能提供足够的相互作用来激活CAR T细胞。

这种方法的可行性已在临床前的模型中被证明，包括一系列不同的抗原，尽管靶抗原的下调已被确定为一种耐药机制。在一项临床前研究中，靶向神经节苷脂GD2的CAR的亲和力通过抗原结合区域的一个单一氨基酸替代而显著提高，小鼠由于CAR T细胞与GD2阳性小脑组织的相互作用而发生致命性脑炎，而在临床前模型或临床试验中未观察到低亲和力的GD2 CAR。这一发现阐明了scFv的细微变化对CAR-T细胞治疗的深远影响。

这些策略的基础是靶向更具体的的肿瘤抗原，优化CAR与癌细胞的相互作用(相对于非恶性细胞)、引入要求多种抗原或缺乏特定抗原的“逻辑门控CAR”，从而限制了CAR的空间和时间活性。

“逻辑门控”条件表达系统

合成生物学模式被用来增加CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性，这些肿瘤细胞是经过多种抗原检测的，以克服缺乏独特的肿瘤特异性抗原的问题。synNotch系统包括使用一个合成的Notch受体（ synNotch受体）来识别一个TAA，其激活可诱导一个编码特异性靶向第二TAA的CAR表达，并包含T细胞激活域，从而创造一个“and”逻辑门控（logic gate），需要同时存在两个细胞表面抗原才能激活CAR-T细胞。

▲图B.逻辑门控and/or条件表达系统（图片来源：参考来源1）

可供选择的策略基于逻辑门控and/or条件表达系统。逻辑门控and/or条件系统：针对特定TAA的CAR的表达依赖于另一种转基因TAA受体（比如synNotch受体）的激活，必须结合多个TAA才能完成CAR-T细胞激活；或者由与肿瘤微环境（TME）相关因素，比如缺氧（缺氧诱导因子，HIF）诱导表达。

基于此，人们也已经开发了相应的方法来限制CAR-T细胞活动的空间分布和持续时间，以限制全身的脱靶毒性。例如，利用低氧诱导因子1α（HIF1α）降解途径来限制，只有CAR-T细胞位于肿瘤低氧微环境是才表达CAR，从而减少对非恶性组织的负面影响(非恶性组织主要是非低氧状态)。(图Bb)

synNotch系统已被用于靶向表达抗原ROR1的肿瘤细胞，该抗原也存在于骨髓基质细胞和其他组织中;与单独靶向ROR1的传统CAR T细胞相比，门控上皮细胞粘附分子(EpCAM)或B7-H3作为二级抗原的表达可增加肿瘤细胞特异性，降低动物模型的毒性风险。然而，这种逻辑门控CAR-T细胞的缓慢激活可能会限制这种方法的有效性，而与逻辑门控效应类似的通过靶向多种抗原或通过其他刺激或抑制手段来提高特异性的策略也在开发。

类门控系统的多抗原调节

与逻辑门控效应类似，通过连接CD3ζ和共刺激域分离的受体，即一个受体具有CD3ζ激活域，第二个受体具有共刺激域，每个受体识别不同的抗原(因此使用第一代CAR 构造结合嵌合共刺激受体)，需要绑定到多个TAA才能完成CAR-T细胞的活化。(图a)

▲分裂CAR（图片来源：参考来源1）

这种方法的前景已在前列腺癌、乳腺癌和其他实验系统的临床前模型中得到证实。类似的方法还包括利用次级嵌合细胞因子受体靶向肿瘤细胞分泌的细胞因子（如IL-4），来限定T细胞对肿瘤组织的活性 ，尽管这些炎性细胞因子的缺点是严格来说它们不是肿瘤特异性的。(图d)

▲图片来源：参考来源1

一个与此相关的策略是基于抑制CAR（iCAR）的使用，这种设计是为了抑制T细胞与非恶性细胞上表达的抗原结合后的激活，从而确保共同表达的激活CAR产生的信号只发生在肿瘤上。不同于共刺激域，iCAR包含免疫检查点蛋白衍生的抑制性域，如CTLA-4或PD-1，从而共同选择内在的免疫检查点信号通路。(图b)

▲抑制CAR（iCAR）（图片来源：参考来源1）

另一种降低传统CAR-T细胞先天毒性潜能的方法是将CAR引入T细胞亚群，使其具有更好的抗肿瘤和安全性。例如γδT细胞，是一种先天具有肿瘤识别能力的T细胞亚群，通过表达带有γδ亚型的TCR(而不是更常见的α β亚型)识别肿瘤细胞代谢紊乱而特异性表达的磷酸化抗原。(图c)

体外实验中，向γδT细胞转导一个靶向GD2的CAR，该CAR只有一个共刺激域导致细胞溶解的反应，针对GD2阳性的神经母细胞瘤细胞而不针对GD2阳性的非恶性组织(因为CD3ζ信号只由与内源性γδTCR结合的肿瘤细胞提供)，这说明潜在的改进这种方法的安全性。

▲图片来源：参考来源1

结语

CAR-T细胞由于能更快和更加明确地清除肿瘤细胞，并且不受T细胞识别杀伤肿瘤细胞的MHC分子识别的限制，使得这一治疗策略具有独特的优势；但CAR-T细胞输注到体内从而产生一系列如细胞因子释放综合征和脱靶效应这样的不良反应，也使其临床应用大大受限。

从CAR的设计上优化CAR-T细胞的性能是一个非常重要的视角，但提高CAR-T细胞治疗的有效性和安全性是一个可以从多角度进行探索的问题，我们期待有越来越多的新的突破设计出最优的CAR-T细胞，造福更多的患者。

参考来源：

1.https://www.nature.com/articles/s41571-019-0297-y

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