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2019年11月27日/医麦客 eMedClub/--近日，由姜儒鸿领导的Applied StemCell团队在Nature子刊Scientific Reports上发表了最新研究，题为“通过基于CRISPR 的人类因子VIII体内基因组编辑改善了小鼠的A型血友病”。
他们开发了一种利用两种rAAV(重组腺相关病毒)载体的基因组编辑疗法，分别编码金黄色葡萄球菌Cas9指导RNA(SaCas9-gRNA)和密码子优化的人B结构域缺失的人FVIII(BDD-F8)。该策略旨在利用CRISPR/Cas9基因组靶向/切割能力，结合非同源末端连接(NHEJ) DNA修复，以位点特异性方式在肝脏特异性白蛋白(Alb)位点整合人B结构域缺失(BDD)-F8，从而在肝脏中产生FVIII。
这种治疗改善了A型血友病小鼠的疾病表型，在长达7个月的时间里促进了肝脏中FVIII蛋白和活性水平的升高，而没有可检测的肝毒性或有意义的脱靶效应。基于这些发现，BDD-F8基因组编辑方法有望为A型血友病患者提供有效、长期和安全的治疗。
血友病是由于关键凝血因子的缺陷或缺乏而引起的一组遗传性出血性疾病。血友病患者会出现自发性出血，通常发生在关节、内脏和颅内，以及与手术或创伤相关的大出血。
大约70-80％的血友病病例是A型血友病，这是一种X连锁疾病，主要影响男性。A型血友病在高收入国家的平均患病率为每十万名男性中12.8±6.0，而在全球则为6.6±4.8。A型血友病是由F8基因的各种突变引起的，导致功能性VIII因子蛋白(FVIII)缺乏。FVIII主要在人肝中的人肝窦状内皮细胞(LSEC)中表达，而不在肝细胞中表达。FVIII作为因子IXa的辅助因子参与凝血，该因子在Ca2+和磷脂存在下将因子X转化为其活化形式Xa。
A型血友病的临床严重程度可能是轻度(正常FVIII活性的5％–50％)、中度(正常FVIII活性的1％–5％)或严重(<正常FVIII活性的<1％)。在中度情况下，患者受伤后出血，也会出现无明显原因的自发性出血。严重的血友病患者除了因正常损伤而出现的出血并发症外，还有反复发作的自发性出血，这些出血可能危及生命，需要立即就医。
目前通过替代疗法、血浆来源或重组FVIII浓缩物的肠胃外给药进行治疗。患有严重A型血友病的患者每周或每隔一天接受3次FVIII浓缩物的预防性输注，以提供高于1%正常水平的FVIII活性。这几乎消除了所有自发性出血，并防止了慢性关节疾病。然而，这种替代疗法受到频繁静脉输注和对输注浓缩物的潜在免疫反应的限制，导致产生抑制性抗体，使患者容易患病和致残。目前，已经开发出具有相对较长半衰期的重组产物和使用多种活化凝血因子相结合的复杂药物来改善替代疗法的疗效。
基于腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法是一种治疗血友病的新兴策略。AAV载体在安全性和递送效率方面都显示出希望，例如，将基因递送到人肝中。AAV2和AAV8载体也已经在临床试验中用于治疗B型血友病。但是对于A型血友病基因治疗，rAAV载体不适合用于递送野生型全长人F8 cDNA(〜7 kb)，因其DNA包装大小限制为≤5kb。
有趣的是，据报道，由一个〜3 kb外显子编码的VIII因子的B结构域对FVIII的促凝活性并不关键。因此，将最小启动子驱动的缺失B结构域的FVIII (BDDFVIII, 4.4kb)包装在AAV中，可以产生适度的FVIII表达。
不久前的11月21日，BioMarin Pharmaceutical宣布已向欧洲药品管理局(EMA)提交了其针对严重A型血友病成人患者的基因疗法valoctocogene roxaparvovec(简称: valrox)的营销授权申请(MAA)，这标志着血友病基因疗法提交的首次上市申请。同样处于临床阶段且进展较快的SPK-8011(Spark Therapeutics)和valrox类似，均使用AAV5作为基因递送载体，而SB-525(Sangamo/辉瑞)则是AAV6，这三款候选产品均编码BDDFVIII转基因。
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然而，基于AAV的基因治疗策略仍然存在局限性。特别是，由AAV递送的治疗性基因表达可能是暂时的，因为包含该基因的病毒基因组以附加体(episome)的形式保留在宿主细胞中。如果载体感染的细胞以高速率复制(例如肝细胞)，则随着时间的流逝，转基因就有可能被稀释，因此基于载体的基因治疗可能不是儿科患者的好选择。一次性注射valrox的3年随访数据显示，患者FVIII活性水平随时间下降，这使人们对该疗法的长期耐久性提出了质疑，尽管BioMarin公司对该疗法的长期疗效和持久性仍然保持信心。
▲ I/II期临床试验的3年随访数据显示，患者FVIII水平随时间下降，这使人们对该疗法的长期耐久性提出了质疑（图片来源：BioMarin）
此外，由于对AAV衣壳蛋白的体液免疫反应会在首次给药后发展，因此通常禁止重复给药。为了克服这些局限性，基因组编辑策略已经被研究用于纠正突变基因，包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统，可能为血友病患者提供终生解决方案。
发表在Nature子刊的最新研究中，Applied StemCell公司使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，在小鼠Alb基因座处以位点特异性方式整合人BDD-F8。
首先，该公司研究人员合成了一个密码子优化的BDD-F8变体，随后在五个靶向计算机模拟小鼠Alb内含子13区域的gRNA候选物中，他们基于检测结果选择了Alb -sg1用于下一步研究。
▲ 靶向小鼠Alb基因座的CRISPR gRNA（图片来源：Scientific Reports）
在哺乳动物细胞中，NHEJ修复途径比HDR修复途径在核酸酶(如Cas9)产生的双链DNA断裂上的工作效率更高，这一点也得到了该研究在HEK-293细胞中的先导实验的支持。因此，该研究选择了基于NHEJ的敲入策略，将人BDD-F8转基因体内插入小鼠Alb基因座。
该团队构建了两个AAV8病毒载体以实现基因组编辑，一个是人BDD-F8供体载体，另一个是SaCas9-gRNA载体。成年C57BL/6小鼠通过尾静脉注射接受了两种AAV8载体AAV8-SaCas9-sg1和AAV8-BDD-F8(1：5)的混合物，结果表明，AAV传递的CRISPR/SaCas9介导的BDD-F8转基因靶向基因组编辑进入小鼠Alb基因座，促使人BDD-FVIII蛋白在小鼠肝细胞中表达。
▲ BDD-F8转基因敲入策略的示意图（图片来源：Scientific Reports）
为了评估该基因组编辑方法在疾病状态下的治疗效果，研究人员使用了敲除小鼠F8基因(缩写为F8KO)的A型血友病小鼠模型。注射后第4周，接受所有AAV剂量的F8KO小鼠的血浆人FVIII蛋白水平升高(通过FVIII ELISA测定)。FVIII水平的增加是剂量依赖性的，并且可能仅反映了整合的BDD-F8转基因，因为ELISA分析对人而非小鼠的FVIII具有特异性。总AAV剂量为6×10^11或3×10^12vg/kg时，治疗小鼠的血浆FVIII达到相当于正常人血浆中〜13％的FVIII水平。
与这些发现一致的是，在所有AAV剂量处理的F8KO小鼠的aPTT(活化部分凝血活酶时间)显著低于媒介物处理的F8KO小鼠，并且具有明显的剂量依赖性。尾巴出血时间测定法检测了28分钟内的失血量，进一步证实了这些结果，表明F8KO小鼠在治疗后的失血量明显降低。特别地，接受最高AAV剂量的F8KO小鼠表现出最小的失血量。这表明通过治疗可以改善A型血友病小鼠模型中的出血性疾病。
▲ 靶向人类BDD-F8转基因的AAV剂量依赖性表达改善了小鼠的A型血友病（图片来源：Scientific Reports）
为了检验基因组编辑的长期治疗效果，研究人员用媒介物或两种病毒载体以1：5的比例和6×10^11 vg/kg的AAV总剂量治疗成年F8KO小鼠，并在0.5到7个月的各个时间点收集小鼠肝脏和血浆样品。
通过实时定量PCR检测到的肝细胞中两个病毒基因组的副本在所有时间点均很明显，尽管在注射病毒后4个月水平似乎有所降低。SaCas9 mRNA在整个7个月内在肝细胞中表达，在3个月时达到峰值。与没有检测到融合mRNA的媒介物治疗队列不同，AAV载体治疗的F8KO小鼠肝细胞中的Alb-2A-BDD-F8融合mRNA水平显著升高。根据这些变化，血浆FVIII蛋白(通过ELISA检测FVIII抗原)和促凝血活性分别达到正常人血浆的〜34％和〜13％。
值得注意的是，在AAV注射后7个月，血浆FVIII蛋白水平仍保持>14％的人体血浆水平。因此，用人BDD-F8转基因进行的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在小鼠中至少维持了7个月的治疗功能。
▲ 靶向人BDD-F8基因表达及FVIII活性的时间进程（图片来源：Scientific Reports）
在0.5-7个月的所有时间点上，用AAV载体或媒介物治疗的小鼠之间的肝功能或毒性指标均无差异，包括血浆白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。在2个月时，两个治疗组的肝组织学均未见明显的形态学异常。在用载体处理的小鼠中观察到肝门静脉周围的轻度淋巴细胞浸润。
为了评估由CRISPR/Cas9引起的潜在脱靶事件，在用媒介物或AAV病毒载体治疗3个月后，研究人员对从F8KO小鼠身上收获的肝脏DNA进行了新一代测序(NGS)研究。根据COSMID在线程序的预测，对Alb基因座上的靶标和小鼠基因组中8个潜在的脱靶位点进行了多达3个错配、1 bp插入或1 bp缺失的检测。
结果发现，在Alb位点上的on-target插入缺失(indel)百分比达到9.38%，而在8个预测的脱靶位点中有6个未检测到插入缺失。一个脱靶位点在基因座区域内没有已知基因的情况下显示0.58％的插入缺失效率，另一个脱靶位点在Pard 3基因的内含子区域内显示1.84％的插入缺失效率。
▲ 通过NGS进行脱靶分析（图片来源：Scientific Reports）
作者写道，尽管仍然需要进一步的分析，但该证据表明该在体基因组编辑方法不太可能在小鼠基因组中产生有意义的脱靶切割事件。
2015年12月21日，CRISPR Therapeutics公司宣布与拜耳(Bayer)公司建立合作伙伴关系，成立一家名为Casebia Therapeutics的合资企业，合力研发适用于SCID、血友病和先天性心脏病的新型CRISPR/Cas9药物。
今年7月，Casebia在国际血栓与止血学会(ISTH) 2019年会上发表了口头报告，证明了接受CRISPR/Cas9基因编辑的A型血友病小鼠中FVIII的稳定可滴定表达。
该公司通过独特的两阶段基因编辑过程实现FVIII的治疗水平表达。研究中，血友病小鼠首先用携带人FVIII编码序列的AAV治疗，随后注射递送CRISPR/Cas9核酸酶的脂质纳米粒子，该核酸酶被设计为将FVIII编码序列插入强天然肝细胞启动子(LNP)之后。给予AAV和脂质纳米粒子的小鼠能够表达正常的人FVIII水平，并且在单剂量AAV后重复给药纳米粒能够逐渐增加FVIII表达。
▲ 独特的两阶段基因编辑（图片来源：Casebia）
今年10月，诺和诺德(Novo Nordisk)和bluebird bio联合宣布达成为期三年的合作协议，双方旨在开发治疗遗传疾病的下一代基因组编辑疗法。此次合作的重点将利用bluebird的基于mRNA的归巢核酸内切酶megaTAL基因编辑技术来开发A型血友病基因疗法。
MegaTALs是单链融合酶，其结合了归巢内切核酸酶(HEs)与DNA结合区域的转录激活因子(TAL)效应子的活性，其基因组识别部分仍然是TALE，与TALEN技术不同，采用的归巢核酸内切酶是单体，这些蛋白质易于工程改造以识别特定的DNA序列。
与诺和诺德在血友病研究和治疗方面的深厚专业知识相结合，这项合作有望使A型血友病基因疗法的发展更进一步。
参考出处：
https://www.nature.com/articles/s41598-019-53198-y
https://www.nature.com/articles/s12276-019-0243-1
https://casebia.com/casebia-highlights-novel-research-in-gene-editing-therapeutics-for-hemophilia-a/
https://hemophilianewstoday.com/2019/07/19/two-stage-gene-therapy-hemophilia-a-shows-promising-results-mouse-model/
https://www.labiotech.eu/medical/novo-nordisk-gene-editing/
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