Science子刊：一种新的纳米颗粒，能够递送基于CRISPR基因编辑的非病毒系统丨医麦猛爆料
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2019年12月11日/医麦客 eMedClub/--CRISPR/Cas是一种大分子复合物，因此很难直接将其传递到细胞核中，而那是它发挥作用的场所。而这就是CRISPR技术应用在临床之前存在的一大技术障碍。
近日，来自约翰霍普金斯大学医学院的科学家在Science子刊《Science Advances》报告了一类羧化支链聚（β-氨基酯）的合成和验证，并基于羧化支链聚（β-氨基酯）创建了一个微型的纳米颗粒，该颗粒可以在细胞内滑动，并递送基于蛋白质的药物和任何大小的基因疗法，包括CRISPR基因编辑。
自组装的聚合物纳米载体系统
病毒具有一些特性使其可以成为理想的载体，例如许多病毒的形状接近球形，带有负电荷和正电荷，总体电荷更中性，病毒可以靠近细胞。由生物医学工程师Jordan Green博士领导的团队正是受到病毒特性的启发，开发了一种自组装的聚合物纳米载体系统，并且该系统可为生物学研究和治疗应用提供通用的蛋白质递送和基因编辑平台。
该聚合物是一种新型的生物可降解的高分子材料，包含四个带正电荷和负电荷的分子，并且这四个分子能够随着时间的流逝分解并溶解在水中。因其具有正电荷和负电荷的平衡，分子根据其电荷推动和拉动，其氢原子与附近的生物疗法结合，使得该纳米颗粒包含生物疗法。
四项试验
霍普金斯大学的研究人员进行了四项实验，以证明纳米颗粒可以进入细胞并在进入内部后进行复杂的治疗。
研究人员首先制造了一种自组装的聚合物纳米颗粒，这些聚合物用于在细胞内递送异硫氰酸荧光素（FITC）标记的牛血清白蛋白（BSA），在孵育4小时后，细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像显示了整个细胞质中弥散的FITC-BSA信号，表明纳米粒子成功逃脱了降解的内溶酶体以实现细胞溶质蛋白递送。
另外在实验过程中，研究人员发现用细胞松弛素D预处理可降低纳米颗粒摄取超过80％，表明纳米颗粒主要是通过巨胞吞作用而被内化。
▲ 细胞的共聚焦图像（图片来源：advances.sciencemag）
为了研究纳米颗粒的坚固性，研究人员使用聚合物成功地封装了FITC标记的人免疫球蛋白G（FITC-IgG）和绿色荧光蛋白（GFP），并实现了两者的弥漫性胞质递送，并且研究人员发现接受治疗的90％的肾细胞显示绿色荧光标记。
研究团队创建了一个纳米颗粒，其中包含基于CRISPR的蛋白质和核酸复合物，当CRISPR化合物切割细胞基因组时，可能会导致关闭绿色荧光信号或使细胞发出红色光。并且研究发现，终止基因的基因编辑在实验室中多达77％的细胞中起作用，并在约4％的细胞中添加或修复了该基因。
▲ CRISPR终止报告基因构建体（图片来源：advances.sciencemag）
为了实现纳米颗粒的更高的长期稳定性，研究人员证明了纳米颗粒在用蔗糖作为冷冻保护剂冻干后仍保持其功效，这可能是功能冻干的首例记录案例核糖核蛋白（RNP）配方。
最后，团队研究了纳米颗粒在体内实现CRISPR基因编辑的能力。在小鼠颅内植入脑癌细胞，10天后，将具有基因编辑成分的纳米颗粒直接注入小鼠的大脑。在输入纳米颗粒6天后，对小鼠进行安乐死，并提取其大脑，组织学分析显示，肿瘤块内有明亮的红色光，表明基因编辑成功。
▲ 图片来源：advances.sciencemag
尽管最强的信号定位在最靠近注射的位置，但是在距离主要注射部位几毫米的地方也可以检测到信号表达，证明了纳米颗粒可以在体内进行CRISPR基因编辑。
该研究团队报告了一种聚合纳米颗粒系统，该系统可以封装并实现多种不同蛋白质（包括有效的细胞毒性剂以及CRISPR-Cas9 RNP）的稳固的细胞溶质递送。生物可降解的纳米粒子是通过一种易于适应，高度可扩展的自组装工艺配制的，该工艺也适用于冻干和储存。这个多功能的蛋白质递送平台为生物学研究以及神经系统疾病及其他疾病的潜在治疗应用提供了强大的工具。
除此之外，该研究团队还表示，他们正在试图使纳米颗粒更加稳定，以便可以将它们注入到血液中，并靶向具有某些遗传特征的细胞。
病毒载体 & 非病毒载体
目前，基因治疗载体可分为两大类：（1）病毒载体，主要包括慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等。（2）非病毒载体，主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等。其中病毒载体是目前最主要的递送方式，临床试验中超过70%的基因药物载体为病毒。
构建病毒载体是一个艰苦而且高成本的过程，基因治疗潜在的脱靶效应可能会造成不可估量的损伤。另外病毒作为载体本身存在致癌风险，存在插入大小限制以及会在人体内产生免疫反应等一系列安全隐患。
例如，逆转录病毒可能造成插入性突变，导致癌症发生，上世纪90年代，就曾经发生过利用逆转录病毒为载体治疗严重复合型免疫缺陷症而导致5名患者患上白血病的不良事件；向静脉高剂量注射AAV用于基因治疗也会产生严重毒性。
近年来，越来越多的科学家开始研究非病毒载体。与病毒载体相比，非病毒载体有一些独特的优点：
非病毒载体通常使用天然的或合成的化合物，毒性较低、免疫原性低，并且具有生物可降解性，降低基因疗法的风险性；
设计非病毒载体时可以进行修饰，使非病毒载体精准性更高；
非病毒载体易于生产、成本较低，其生产流程能够更加标准化，大规模生产更为容易。
除了本次约翰霍普金斯大学医学院的研究团队开发的聚合物纳米载体系统以外，还有不久前，由Tufts University与中国科学院合作研究开发的一种可生物降解的合成脂质纳米颗粒（BAMEA‐O16B）；澳大利亚Griffith大学的科学家利用“隐形”纳米颗粒作为载体，使用CRISPR/Cas9编辑系统成功地在小鼠体内定位和治疗宫颈癌等。
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越来越多关于非病毒载体的研究报道，都在说明了该技术在不断优化，一旦非病毒载体的技术更加成熟之后，我们可以遇见将会有更加广阔的应用范围。
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