年度盘点：以AAV为载体的基因疗法研发现状丨 星耀研究院

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2019年12月18日/医麦客 eMedClub/--近年来，重组腺相关病毒(AAV)已成为主要基因递送载体之一，通过递送新的或替代基因来编码人类治疗蛋白，在临床上显现了令人印象深刻的结果，应用也越来越广泛。迄今为止有三种以AAV为载体的基因治疗产品获得上市批准。

• 2012年，被EMA批准Glybera用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)，为第一个正式批准上市的人用AAV基因治疗产品，售价120万美元，因销售情况堪忧，于2017年黯然退市。

• 2017年底，FDA批准Spark Therapeutics公司的Luxturna 用于治疗遗传性视网膜疾病，成为首款在美国获批的“体内给药型”基因疗法，定价85万美元。

• 今年5月24日，诺华的Zolgensma获美国FDA批准上市，用于治疗2岁以下脊髓性肌萎缩症(SMA)患儿，患者存活运动神经元1 (SMN1)基因存在双等位基因突变；定价212.5万美元，成为全球最为昂贵的药物，是目前为止FDA批准用于治疗SMA患者（包括在诊断时尚未出现症状的患者）的首个也是唯一一个基因疗法。

作为递送基因疗法的有力工具，AAV具有无致病性、高效的长期基因表达、易于基因操作以及免疫反应低的特点，令人满意的一系列特性是其作为基因递送工具的重要原因。以下对其近一年的技术开发、临床研究以及治疗适应症的进展情况做一个大致的概述。

技术开发进展

• 启动子技术：准确靶向，提高疗效

专注于开发AAV基因疗法的Asklepios BioPharmaceutical (AskBio)一直致力于基因控制合成启动子技术、生物信息学和智能数据驱动设计领域，以实现更精确的细胞靶向和基因表达。2019年8月，AskBio宣布收购了Synpromics，它是于2010年由Michael L Roberts博士创建的，拥有专有的数据驱动启动子设计和生物信息学平台PromPT™，帮助生产突破性的细胞选择性合成启动子，以及调控和诱导基因表达的解决方案。

通常，天然存在的启动子在工业或治疗应用中具有局限性，而Synpromics的合成启动子旨在更好地调节基因活性和精确控制蛋白质生产；AskBio的AAV技术、衣壳库、专有制造系统和多维基因治疗平台，结合Synpromics的启动子和生物信息学技术，能够为更准确地靶向复杂疾病、提高AAV基因治疗载体的疗效创造强大的机会。

• 人工智能：指导设计AAV衣壳的技术

2019年11月，人类遗传学大牛乔治·丘奇 （George Church）带领哈佛大学Wyss研究所在Science上发表了一篇论文，该研究报告生成了完整的一阶AAV2衣壳适应度图谱，并验证了通过机器指导设计AAV衣壳进行有用变异，其效率要比随机诱变高得多。

在该研究中，由丘奇领导的团队利用了最先进的合成生物学武器库，其中包括下一代DNA合成，条形码和DNA测序功能，构建迄今为止最全面的AAV衣壳库。

• 筛查AAV位点的新技术：捕获AAV载体瞬时、低水平的转基因表达

2019年7月，费城儿童医院（CHOP）的研究人员在Nature Communications杂志上发表了一篇研究论文，该研究团队开发了一种更灵敏的捕获AAV载体足迹的方法（即AAV载体转移遗传物质的位点），其能捕获到AAV载体瞬时、低水平的转基因表达。

通过该方法揭示了许多以前未知的AAV表达位点，并突出了在AAV递送后可能在其他器官和细胞类型进行基因编辑的位点，该方法拓展研究人员对已知向性组织内AAV表达的范围，较之传统筛查AAV方法，其显示出显著的优越性，其从根本上重新定义了AAV介导的基因转移的真实程度，通过捕获由AAV载体引起的全部基因表达，该技术有望显著推进基因治疗领域的快速发展。

临床研究进展

• 新型AAV变体AAV-ie：用于耳聋基因治疗

8月19日，权威期刊Nature Communications上在线发表了一篇论文，由上海科技大学钟桂生课题组、东南大学柴人杰课题组与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟课题组合作完成，该研究团队开发出一种新型AAV变体AAV-ie，可用于小鼠内耳中的基因递送。

其研究结果表明，AAV-ie具有安全感染小鼠耳蜗支持细胞(SCs)和毛细胞(HCs)的能力，且具有较高的感染效率，代表了对传统AAV血清型的巨大改进。考虑到部分耳聋基因主要影响SCs功能，且SCs具有再生HCs的能力，AAV-ie不仅在纠正遗传性听力损伤方面，而且在HC再生治疗环境和年龄引起的听力损失方面具有重要的潜力。

• 双AAV策略——重组AAV载体方式：治疗先天性耳聋
  

遗传性耳聋是新生儿常见的疾病，发病率大约1/1000，且80%是常染色体隐性遗传(DFNB)，20%为显性。DFNB9耳聋的患者通常缺乏编码otoferlin的基因，而otoferlin是一种在耳蜗内毛细胞(IHC)突触中传递声音信息所必需的蛋白质。通过耳蜗内注射基因疗法，科学家们成功地将成年DFNB9小鼠模型中的听觉突触功能和听力阈值恢复到接近正常水平。

2019年2月，法国科学家在PNAS上发表了一篇论文，在最新的研究中，研究人员通过称为双AAV的策略，使用了两种不同的重组AAV载体，一种携带otoferlin cDNA的5'-片段(Otof NT, 核苷酸1-2,448)，另一种携带3'-片段(Otof CT, 核苷酸2,449-5,979)，两种载体能够通过其反向末端重复重组并产生多联体，并且所得转录物可以正确剪接产生蛋白质otoferlin。

该研究中的基因治疗不仅成功地防止耳蜗正在发育的Otof -/-小鼠的耳聋，并且耳蜗完全发育后给药，也能以持续的方式逆转耳聋表型。

• AAV中和抗体（NAb）：或不阻碍眼科基因疗法的应用

2019年10月21日，美国应用基因技术公司(AGTC)报道研究结果表明，眼内施用AAV载体后，血清或眼睛中存在针对AAV的中和抗体（NAb）不会影响基因传递，基因表达或眼睛炎症。

AGTC首席科学官兼学术海报的主要作者Mark Shearman博士说：“虽然眼睛具有部分免疫特权，并且看起来受NAb的影响较小，但充分了解眼内施用基于AAV的基因疗法后发生的载体中和度对于批准临床阶段候选药物及其安全性。安全性至关重要，这有关于在患者中有效的使用。即将提供的数据支持我们的AAV载体的安全性和效率，而与NAb水平无关，这些数据能够允许在更大的患者群体中使用这些载体。”

• AAV基因疗法：治疗天冬氨酰葡糖胺尿症(AGU)和CMT4J类的神经系统疾病

AGA是一种由AGA基因功能障碍引起的疾病，这导致大量的存储物质在身体的许多组织中堆积。研究人员表示，通过AAV治疗，促使“中枢、外周组织和体液中的毒性底物的剂量依赖性，完全或几乎完全消除”。小鼠对这种疗法的耐受性很好。

CMT是一组影响运动和/或感觉周围神经的疾病的总称，有些CMT会使人衰弱，但人们可以活很长时间，不影响寿命；但CMT4J可能“进展很快”，这是由FIG4基因功能障碍引起的使人衰弱的周围神经病变，导致呼吸窘迫，最终致命。针对该病，非同行评审的数据显示出AAVDE 治疗前景良好。

研究人员表示，Neurogene公司的AAV基因疗法能够“促使生存、运动功能、神经传导速度和组织病理学的剂量依赖性、显著的改善”。该公司在研讨会上提出的临床前数据为AGU和CMT4J基因治疗计划的结果提供了积极证据，以支持未来的首次人体临床试验。

• 基于AAV9的CRISPR基因编辑技术 / 启动子结合AAV方法：治疗杜氏肌营养不良症（DMD）

杜氏肌营养不良症（DMD）是由于在X染色体上编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的基因上出现突变而导致的罕见但具有破坏性的遗传性疾病，如果没有该蛋白，肌肉细胞就会变得脆弱，可导致肌肉萎缩和身体损伤最终死亡。

2019年9月，密苏里大学医学院(University of Missouri School of Medicine)的研究人员在一项小鼠研究中表明，基于AAV9的CRISPR基因编辑技术，可以被用来有效地编辑肌肉干细胞（MuSCs）,编辑的细胞中再生的细胞成功地产生了dystrophin，这可能为终生纠正导致杜氏肌营养不良症（DMD）的基因突变提供了一种潜在的方法。而它的优势在于永久性的改变了DMD患者突变基因的结构，因此理论上只需要一次治疗，就可以让患者终生受益。

此外，另一种将MHCK7启动子与AAVrh74载体结合的方法，也被证实以提供设计用于维持血清蛋白样重复序列2和3的微型抗肌营养不良蛋白转基因。与AAV9载体相比，AAVrh74旨在增强肌肉中的表达。研发的整个试验过程中没有发现针对微型抗肌营养不良蛋白的免疫反应。安全性信号仍为阳性，患者继续表现良好且没有不良副作用的证据。

• 基于AAV5载体递送miRNA的基因疗法：治疗神经退行性遗传疾病

亨廷顿病（Huntington’ s disease, HD）是一种罕见的、致命的神经退行性遗传疾病，又称慢性进行性舞蹈病、大舞蹈病。该疾病是由常染色体显性突变引起的，在亨廷顿基因（Htt）的第一个外显子中存在CAG三核苷酸的异常重复扩增，导致产生在大脑中聚集的突变蛋白。

▲ AMT-130机理图（图片来源：uniQure）

uniQure的基因治疗产品候选药物AMT-130利用其专有的miQURE™沉默技术，由携带人工微RNA（micro-RNA, miRNA）的AAV5载体组成，治疗目标是抑制突变蛋白（mHTT）的产生。研究人员认为，使用AAV载体将微RNA直接递送到大脑中以非选择性地敲低亨廷顿蛋白基因，这代表了治疗亨廷顿氏病的高度创新和有前途的方法。2019年1月，该疗法的IND申请获得FDA的审批。

• 基于AAV血清型hu37的载体，治疗A型血友病

A型血友病是凝血因子VIII（FVIII）缺乏所导致的出血性疾病，约占先天性出血性疾病的85%。

▲ DTX201的耐受性（图片来源：sec.gov）

DTX201（AAVhu37 FVIII）是一种基于非复制性腺相关病毒（AAV）血清型hu37的载体，其中包含一条编码B结构域中缺失FVIII的单链DNA基因组，它通常在优化的肝脏特异性启动子和增强子的组合控制下进行转基因表达。其中AAVhu37衣壳是在非临床研究的基础上筛选出来的嗜肝性枝E家族的一员，临床研究显示了它有效的肝定向FVIII基因转移，良好的生物分布以及持久的FVIII表达。

作为首个基于AAVhu37血清型的临床级AAV基因治疗载体， 在其1/2期临床试验中表现了它首次静脉输注后的安全性和FVIII活性，使其成功的从临床前转化为临床发展。

• 基于AAV5载体的FIX-Padua变体组成基因疗法：治疗B型血友病

B型血友病是凝血因子IX(FIX)缺乏引起的凝血功能障碍，又称为Christmas病，约占血友病的15%～20%，发病率大约为3.5万分之一。

AMT-061是一种由AAV5载体和受专利保护的FIX-Padua变体组成的基因疗法。临床数据显示，在单次施用AMT-061后，全部三名患者中FIX活性临床显著升高持续达六个月，可用于治疗严重和中度严重的B型血友病患者。目前，该疗法已获得美国食品和药物管理局(FDA)的突破性治疗指定，并获得了欧洲药品管理局(EMA)的优先药物(PRIME)监管倡议。

AAV生产的困局

从已获批上市的3种AAV基因疗法以及正在研发的相关进展可以了解到，AAV 基因疗法的潜力是巨大的。但其制造过程十分复杂，限制因素多，这已成为整个行业的瓶颈，尤其是在病毒颗粒转染到宿主哺乳动物细胞的过程中，如果对病毒的纯化不到位，那么在试验过程中，难以转染的细胞或整个动物甚至是人类就极易发生感染事件。

这就需要在重组腺相关病毒（rAAV）下游加工期间，从产物中除去大量宿主细胞和产物相关的杂质。宿主细胞DNA和蛋白质是在AAV制造过程中去除的最有问题的污染物之一，以染色质形式出现紧密堆积的复合物。典型的市售核酸酶很难分解染色质，因为它受到宿主细胞DNA强烈的组蛋白关联的保护。而实验室规模成功的纯化，例如氯化铯纯化，当该工艺转移到更大的工业规模时又缺乏可扩展性。因此使用正确的瞬时转染方法对病毒载体生产至关重要，以确保从工艺开发到高质量级别病毒载体生产的灵活性和可重复性。

建立符合GMP要求的AAV生产工艺

在AAV生产过程中，对于安全性、纯度以及质量等已有明确的质量控制要求。其中对安全性要求有内毒素含量、悬浮颗粒、无菌等控制；而影响纯度的杂质主要来源于产品相关和工艺相关。产品相关空壳rAAV和完整的rAAV（完整的rAAV才能够具有感染能力，才具有治疗效果）。工艺相关杂质是在病毒产生的过程中，引入到生产过程的物质；本身质量要求主要涉及pH、渗透压、外观、病毒聚团等。以下为具体质控标准。

法国Polyplus-transfection®提供一系列基于PEI的高品质转染试剂，研发级PEIpro®可用于工艺开发过程中建立病毒载体生产体系，临床前级PEIpro®-HQ和最高质量级别即完全GMP级别的PEIpro®-GMP可用于临床病毒载体的生产，满足细胞治疗和基因治疗的质量要求。

其中PEIpro®-GMP是最高质量级别的PEI，是市场上唯一提供带有MPC连接器和焊接管的袋装转染试剂，非常适用于制造符合GMP标准的临床级治疗性病毒载体（如AAV和慢病毒）的封闭生产系统。

▲PEIpro®产品系列 （图片来源：Polyplus官网）

它是根据欧盟《人用和兽用医药产品良好制造实践指南》（ICH Q7 和 Eudralex 卷 4，第二部分，附件 1）制造的，因而十分适合用做临床试验和商业化所需的治疗性病毒载体的生产原料。以下为该产品具体技术指标。

▲PEIpro®-GMP产品说明（ 图片来源：Polyplus官网）

该公司目前已提供了从用于工艺开发到大规模临床级的病毒生产直接放大和无缝过渡的PEIpro®系列产品，不同质量等级的PEIpro®试剂满足核酸介导的每个阶段的病毒载体的生产，具有众多优点：

• 高滴度病毒生产的最佳选择

• 与磷酸钙相比能得到更高病毒滴度

• 批次间有很好的稳定性和可重复性

• 经优化的线性聚乙烯亚胺（PEI），毒性更低，转染效率更高

• 与其它PEIs相比，PEIpro®所需更少转染试剂和较少/相似的DNA用量

由此可见，其GMP级的PEIpro®-GMP专为临床试验及商业化生产设计，完全满足细胞治疗和基因治疗的质量要求，其作为最高质量等级的PEI转染试剂能够生产用作人用ATMP临床试验和商业化所需的病毒载体。

结语

基因治疗代表了治愈人类疾病的前沿技术之一，其中用rAAV作为载体的临床实验更是呈指数性增长，对于符合GMP的AAV生产的需求也会不断增加。

在未来，随着AAV领域的扩大所带动的基因治疗药物的开发，未来会着重加强载体优化、改进生产方式及效率。建立符合GMP的AAV生产方式，也将有望降低制造成本以及保障药物质量，为其更好的应用于基因治疗打下坚实基础。

对GMP转染试剂有意者请联系：

刘海芹，商务经理

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