鲍曼不动杆菌生物膜与耐药性
鲍曼不动杆菌生物膜与耐药性
耐药菌导致的感染性疾病是全球性热点问题之一。作为一种常见的革兰阴性杆菌，鲍曼不动杆菌广泛存在于环境中。鲍曼不动杆菌感染，尤其是耐药鲍曼不动杆菌导致的院内感染是临床工作中的难题[1]。随着植入性医疗设备如导管、人工假体等应用增加，鲍曼不动杆菌形成的细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)感染日益增多，BBF的形成可显著提高膜内鲍曼不动杆菌对抗生素的耐受性，使原本对游离态菌体有效的抗生素药效降低、甚至失效[2]。本文从BBF的角度就鲍曼不动杆菌的耐药机制进行综述，以期为制定适宜的抗感染治疗方案及防控耐药性鲍曼不动杆菌BBF提供指导。
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1 针对鲍曼不动杆菌的临床用药现状
针对鲍曼不动杆菌，目前临床上常用的抗生素包括舒巴坦及含舒巴坦的β-内酰胺类复合制剂、碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南、帕尼培南及比阿培南)、多黏菌素类、四环素类、氨基糖苷类和替加环素等[3]。近年来，由于抗生素的广泛使用以及鲍曼不动杆菌强大的获得性耐药能力，鲍曼不动杆菌的耐药性不断增强，陆续出现了多重耐药鲍曼不动杆菌、广泛耐药鲍曼不动杆菌、泛耐药鲍曼不动杆菌。针对前两者感染的治疗通常联合使用两种或者两种以上抗生素，也有将抗生素与中药联用的尝试[4]。然而，对于最后者感染的治疗仍比较困难，常用抗生素以多黏菌素类居多。此外，还有一系列新型抗生素如依拉环素、安普霉素、度洛巴坦、SPR741(NAB741)等，被开发用于治疗不同耐药鲍曼不动杆菌引起的感染[5]，随着上述药物在临床应用的推广，将会有更多的数据用于评价新型抗生素的治疗效果及对细菌耐药性的影响。
2 鲍曼不动杆菌耐药机制的多样性
鲍曼不动杆菌获得性耐药机制具有多样性，主要包括以下几个方面：(1)菌株产生灭活酶，其中能够水解碳青霉烯类抗生素β内酰胺环的D组OXA-23酶[6]最为常见，头孢菌素酶[7]、B类金属β内酰胺酶和超广谱β内酰胺酶[8]也在部分菌株中被检测到；(2)改变抗生素的作用位点，如拓扑异构酶gyrA、parC基因突变引起鲍曼不动杆菌对喹诺酮类抗生素产生耐药性[9]，16S rRNA甲基化酶使得鲍曼不动杆菌几乎对所有氨基糖苷类抗生素耐药[10]；(3)胞内药物浓度下降，其中细菌外排泵基因的高表达以及细菌外膜孔蛋白通透性的下降起着关键作用[11]；(4)BBF的形成[12]。
3 鲍曼不动杆菌BBF的形成
BBF是指细菌为了适应外界环境，黏附在无生命或有生命的物体表面后，由细菌自身产生的多聚体物质包裹的有组织的细菌群体[13]。鲍曼不动杆菌具有很强的形成BBF的能力，能够在呼吸道、体内植入物等表面形成BBF而长期存活。鲍曼不动杆菌形成BBF的能力增强了其对抗生素的耐药性，在BBF的保护下细菌对抗菌药耐受性提高了10~1 000倍[12]。
BBF的形成大致分为4个过程。首先，细菌聚集到载体表面；随后，细胞之间相互黏附并开始增殖，在繁殖过程中分泌出胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)于载体表面形成聚集态；第三阶段为局部BBF的形成，该膜为细菌生发繁殖过程中形成的三维结构的BBF；最后，BBF分散，释放出单个细菌，寻找载体，进行下一个周期[14]。目前BBF耐药机制主流的学说分别是：营养限制、免疫逃逸以及渗透阻隔[15]。营养限制指BBF内细菌因缺氧和营养匮乏，导致BBF内细菌处于不敏感态，抵御抗生素的杀伤。免疫逃逸指因BBF的存在，机体对菌体的识别以及各免疫细胞的协同抗菌作用减弱，从而使得菌体逃过了机体的防御机制。渗透阻隔指BBF中菌体密度大，可利用空间少，且被大量基质填充，这样就形成了一道阻隔抗生素的"墙"，这就使得抗生素难以发挥作用。关于临床鲍曼不动杆菌分离株的研究显示，多重耐药菌形成BBF的能力显著高于非耐药菌株[16]。BBF一旦形成，便成了细菌的"大本营"，这是菌体逃避机体免疫监视及防止抗生素清除的主要原因。
4 鲍曼不动杆菌BBF的调控因素
BBF形成过程受多个因素调控，主要与菌毛合成、细菌EPS、密度感应(quorum sensing，QS)系统相关。
4.1 菌毛合成
黏附在细菌BBF的产生中扮演关键角色，是形成BBF的初始阶段。研究证明，菌毛在细菌黏附于非生物或生物外表以及形成微菌落过程中发挥着重要作用。菌毛的合成受到菌毛伴侣引导(chaperone-usher，CU)家族蛋白的调控，CU家族蛋白由1个包含6个基因的操纵子(csu)编码。这6个基因分别为：csuA/B、csuA、csuB、csuC、csuD和csuE，它们编码的蛋白构成了菌毛合成调节系统[17]。其中，编码菌毛亚单位结构的基因分别是csuA/B、csuA、csuB。伴侣蛋白由csuC编码，协助菌毛蛋白的转运。引导分子是一个具有孔道的蛋白，由csuD基因编码，能与黏附素结合[18]。作为菌毛合成调节系统的关键部分，csuE基因编码菌毛尖端黏附素，该蛋白在菌毛黏附中发挥重要作用，缺失该基因的细菌无法合成菌毛。菌毛的组装有赖于分子伴侣引导合成系统，伴侣蛋白结合到菌毛亚单位以稳定并防止其水解[19]；引导分子在细菌外膜形成孔隙，与伴侣蛋白一起组装菌毛。研究发现，生物膜主调节因子/感受器激酶(biofilm master regulator/sensor kinase，BfmR/S)双组分调控系统由调节因子BfmR和感受器激酶BfmS组成，调控csu菌毛合成系统[20]。当BfmS活性正常，而BfmR受抑制后，csu基因不能表达，菌毛难以产生，阻断了培养基中细菌的黏附和BBF的合成[21]；当BfmS活性受到抑制，则会降低BBF的形成能力。Liou等[22]证明，在BfmS失活的情况下鲍曼不动杆菌ATCC 17978株BBF形成有一定减少。
4.2 细菌EPS
β-(1，6)-乙酰葡萄糖胺是鲍曼不动杆菌的主要EPS，该多糖在静止条件下不影响细菌BBF的形成，但在压力作用和震动下会影响BBF的完整性[23]。ATCC 17978株鲍曼不动杆菌的O-糖基化系统能够提高BBF的形成能力，糖基化可以促进初始的黏附，提高成熟BBF的质量和密度，推测多聚糖蛋白在菌体间黏附发挥作用[24]。荚膜多糖是鲍曼不动杆菌的主要毒力因子之一，可增加菌体对补体和抗生素的抵抗能力。磷酸糖基转移酶PglC在鲍曼不动杆菌荚膜多糖的合成中发挥主导作用，pglC基因突变可阻止合成荚膜多糖的进程，进而导致BBF结构异常、表面粗糙[25]，提示荚膜多糖可能与BBF的组织结构有关。
4.3 QS系统
QS是细菌为了维持种群密度而进行交流的模式，这一调控机制是密度依赖性的，并建立在自体诱导物(autoinducer，AI)，即细菌之间产生的信号分子的基础之上。AI的浓度随着菌落数量的增加而增加[26,27]，当达到阈值浓度时，细菌对其产生感应并摄取，某些基因的表达得以改变，从而调节细菌的相关性状，此种变化能帮助细菌提高对诸多不利环境的适应性[28]。
鲍曼不动杆菌的QS由两部分组成：酰基-高丝氨酸内酯(acyl-homoserine-lactone，AHL)合成酶(AHL synthase，AbaI)诱导分子及其同源受体AbaR[29]。AHL作为AbaI基因自动诱导的产物，在BBF形成的终末阶段起着显著作用。QS促进了BBF的形成，而BBF是鲍曼不动杆菌多药耐药的重要潜在因素之一，故引发这一过程的QS可能是抗菌治疗的新靶点[26]。近年来，通过植物提取物、合成化合物或AHL降解酶抑制QS，诱导QS调控基因过早表达，靶向AbaI抑制剂，调控AbaR的活性，拮抗AI、阻断细胞内通讯以阻碍QS，或者破坏QS，并进一步调控BBF的产生和可能产生的其他毒力基因，可以提供对细菌性疾病的广谱控制[30]。
5 亚致死剂量抗生素对鲍曼不动杆菌耐药性的诱导
临床抗生素使用剂量通常是结合药物体外条件下能够显著抑制游离态细菌的最低药物浓度，即最小抑制浓度(minimal inhibition concentration，MIC)和药物对机体的毒副作用浓度确定的，以期既能杀死感染部位的细菌又不会对机体产生损伤。然而，基于游离态细菌测定的MIC未必适用于BBF中细菌对药物的反应。抗生素从BBF表面渗透到内部的过程中会被稀释甚至降解，导致作用于BBF内细菌的抗生素浓度往往为亚致死剂量。
亚致死剂量是指尚未导致细菌死亡但能引起其行为、生理、生化和组织等方面发生变化效应的药物剂量。当细菌暴露于亚致死剂量的抗生素后，会上调基因突变率，促进一系列转录的基因和蛋白的表达变化，使细菌抵御外部压力和避免被杀灭[31]。研究发现，亚致死剂量的β-内酰胺类、喹诺酮和氨基糖苷类可上调细菌内活性氧水平[32,33,34]。这类含有羟基自由基的活性氧分子可直接损伤DNA[35]，随后会激发细菌基因组错误的DNA修复反应，进而导致累计突变增加耐药菌产生几率[36]。亚致死剂量的抗生素同样会对BBF产生影响，这种影响不仅包括BBF结构、菌体形态、生长速率、菌体外DNA的产生和菌体膜囊泡释放等表型变化，还涉及转录因子、应激反应、SOS应答、氧化应激、群体感应和信号分子的变化[37]。
6 结论与展望
鲍曼不动杆菌是导致院内感染的主要条件致病菌之一。近年来，耐药鲍曼不动杆菌的院内检出率逐年增加，是临床医师面临的巨大挑战。研究发现，鲍曼不动杆菌的耐药机制复杂多样，比如产生灭活酶、抗生素作用靶位改变、细菌外排泵系统及形成BBF等，其中BBF的形成是鲍曼不动杆菌致病及耐药的重要机制。综合分析文献，我们得出本文结论：细菌菌毛、表面蛋白、EPS、QS系统是调控BBF形成的重要因素，而BBF导致的抗生素稀释至亚致死剂量及其对耐药变异的促进作用，很可能是鲍曼不动杆菌耐药性不断增强的重要机制之一。
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