内毒素休克病理生理

什么是内毒素？

内毒素是包在革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。它们代表了制药和医疗设备企业而言最重要的热原。内毒素之所以重要，是因为它们在环境中无处不在，热稳定好且不可以过滤去除。重要的是，它们极易热解。内毒素刺激单核细胞和巨噬细胞分泌一系列炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白介素（IL）-1族、IL-6、IL-8、IL-10族、IL-12族、IL-15族和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）。

通常，LPS具有三个结构组件。脂质A、LPS疏水部分、亲水性杂多糖核心区域和O型特异性寡糖区域，他们在血清型中因菌株而异。核心区域的第一个糖（3-脱氧-D-甘露糖辛酸或KDO）连接到6'位置，并将核心多糖连接到脂质A。LPS的所有生物活性都存在于脂质中一个区域。

脂质A具有一个在位置1'和4'处带有磷酰基的β二葡萄糖胺主链。对于大肠杆菌和革兰氏阴性细菌肠杆菌科的其他成员，此主链在2、3、2'和3'位置被β-羟基肉豆蔻酸酯酰化。仲酰基分别在2'和3'位置被月桂酸酯和肉豆蔻酸酯化。这里描述的脂质A结构是经典结构，并且是天然免疫应答最强大的激活剂之一。

并非所有革兰氏阴性生物都产生激活先天免疫应答的脂质A结构。活化取决于磷酰基的存在，酰基链的数量和酰基链的长度。来自幽门螺杆菌，鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌的LPS具有致病性，但是它们的LPS结构很难被Toll样受体（TLR4）识别，因此可以逃避宿主检测。即使在肠杆菌科家族中，经典的LPS体系结构也会发生变化。在低镁和低pH的条件下，发生棕榈酸酯添加和糖脂A磷酸基团与阳离子糖或磷酸乙醇胺的修饰。在高铁、铝和钙的环境中也会发生改性。来自所有革兰氏阴性细菌的LPS不断进行修饰或重塑。脂质A的重塑取决于环境条件，并主要通过PhoP-PhoQ和PmrA-PmrB两组分调节系统进行控制。

革兰氏阴性细菌的外膜高度不对称，内部小叶中含有甘油磷脂，而暴露于细胞表面的LPS则含有LPS。它用作渗透屏障。大多数营养物质通过称为孔蛋白的外膜蛋白（OMP）家族穿过此屏障。外膜的变化会影响其完整性、流动性和渗透性。LPS和外膜成分的重塑代表了一种协调的生存方式。外膜囊泡（OMV）具有革兰氏阴性细菌分泌过程，可促进外膜的重塑。

外膜囊泡是由革兰氏阴性细菌普遍产生的纳米颗粒。它们的直径范围为20–250nm，并且包含不再需要的或对生存有害的蛋白质、脂质、LPS和其他生物活性物质。它们通常具有与精心制作OMV的细菌外膜相似的成分。OMV产生是细菌的应激反应，对于养分获取、生物膜发育、水平遗传交换以及复杂微生物群落中发生的其他种间相互作用具有重要作用。这些区经常处于温度和营养压力之下。这些微生物群落的内毒素无法在实验室中产生，因为存在季节性和其他本地因素，这些因素赋予了当地特色。这些微生物种群存在于所有制药操作中。

内毒素导致多脏器损伤的机制

内毒素脓毒症仍然位居全世界重症医学科（ICUs）死因的首位。免疫系统对脂多糖（LPS）的识别会导致信号通路级联样触发，释放多种具有抗菌抗炎作用的细胞因子和趋化因子，但同样也能导致多脏器损伤。此外，内毒素还参与到了固有和适应性免疫系统的变化，对脓毒症免疫麻痹的发生至关重要，而且会导致脓毒症后期死亡率升高。尽管迄今为止内毒素清除技术的临床研究结果不一致，但似乎其中特定的亚组患者是能获益的。

脓毒症仍然位居全世界ICU死因的首位 (Vincent et al. 2009)并被视为全球卫生工作重点 (Reinhart et al. 2017)。2016年发表了新的脓毒症定义和诊断标准，强调了针对感染导致稳态失衡的宿主反应在这一综合征发生发展中是至关重要的 (Singer et al. 2016)。

多种原因导致脓毒症发病率在上升，而且由于多重耐药菌的传播使得治疗日益困难。ICU革兰阴性菌感染逐渐增多。2007年ICU患者培养分离的菌株62%是革兰阴性菌 (Vincent et al. 2009)；再者，就病死率而言，革兰阴性菌高于革兰阳性菌 (Cohen et al. 2004)。

内毒素属于病原体相关模式分子

内毒素(脂多糖)可能是革兰阴性菌感染炎症反应最重要的触发机制。内毒素由三部分组成（LPS、蛋白质和磷脂）（注：LPS由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖、脂质A三部分组成，毒性成分主要是脂质A），是革兰阴性菌细胞壁的基本成分，结构高度保守 (Opal and Gluck 2003)。但，致命的是LPS作为介质所引起的宿主反应调控，而非LPS的固有特性。固有免疫反应是感染的第一道防线，以病原体结构的识别为基础，被称作病原体相关模式分子（PAMPs），其对微生物的生存至关重要，因此亘古未变。当PAMPs ，如LPS、革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸、真菌的葡聚糖，(Marshfield 2011) 与所谓的模式识别受体（PRRS）结合，促炎和抗菌反应就会被触发。值得注意的是，细胞应激导致宿主片段发生改变同样能被PRRs识别，当作损伤信号，称作损伤相关模式分子（DAMPs） (Mogensen 2009)。

Toll样受体（TLRs）属于PRRs家族，研究非常充分。目前被阐述的TLRs已有十种。TLR-4与LPS和热休克蛋白（HSP）具有相互作用(Opal 2010; Saha et al. 2010)。LPS通过LPS结合蛋白与 CD14[V1] /TLR4/MD2复合体（免疫和非免疫细胞都有表达）相结合 (Molteni et al 2016)。然后，产生两种不同的细胞活化途径，要么是通过MyD88 (髓样分化因子88)，其介导核因子κB(NFκB)早期活化，主要导致促炎因子合成（TNF-α，IL1B，IL-6， IL12B），要么是通过TRIF（β干扰素Toll样受体结构域衔接蛋白），与MyD88相反，其参与晚期转录活化（IL-10）和内毒素耐受的产生(Biswas and Lopez-Collazo 2009)（图1A）。

LPS的临床意义

内毒素血症与预后的关系最明显的例子是脑膜炎球菌性脑膜炎(Cohen 2000)。即便是这种关联要在异质性显著的ICU患者中证明也非常困难，一些研究已经突显了内毒素血症对脓毒症和脓毒性休克的进展和预后所起的作用(Danner et al 1991; Opal et al 1999)。

2004年MEDIC研究纳入了857例ICU患者，是研究内毒素水平与病死率之间相关性的第一个大规模队列观察研究，采用内毒素活性测定（EAA）。内毒素活性低、中、高水平患者的严重脓毒症发病率分别为4.9%、9.2%、和 13.2%，ICU病死率分别为10.9%、13.2%、和16.8% (Marshall et al. 2004)。同样，一项前瞻性研究中，Monti 等(2010) 证明“内毒素活性水平高的脓毒性休克患者”确实要比中等和低水平组所需的升压药物药量明显更大，同时院内死亡率也增加。

有趣的是，内毒素活性不仅仅能在革兰阴性菌感染患者检测到。超过50%的ICU患者与健康志愿者相比内毒素活性处于中高水平；但，仅有4%患者能够明确是革兰阴性菌感染(Monti et al. 2010)。推断那些患者内毒素升高的背后原因是内脏低灌注有关的肠道屏障功能障碍(Esteban et al. 2013)或者是肠道通透性改变 (McIntyre et al. 2011; Klein et al. 2007)。

革兰阴性菌脓毒症器官损伤的病理生理

内皮功能障碍及其导致的屏障不连续造成血管通透性增加是脓毒症多脏器衰竭的重要发病机制(Winkler et al.2017)。尤其是，LPS对内皮细胞的刺激导致多种粘附分子（E-选择素、P-选择素、细胞间粘附分子-1等）、细胞因子（IFN-α、INF-γ、IL-6）和趋化因子（CCL2、CCL3、CCL5[gz1] ）表达上调。再者，内毒素降低血栓调节蛋白、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂和肝素的表达，同时增加组织因子（TF）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达，因此打破了出凝血平衡，导致从抗凝转变为促凝状态。在健康志愿者静脉注射低剂量LPS导致单核细胞TF mRNA水平剧烈上升，导致凝血酶产生，进一步激活凝血(Levi and Sivapalaratnam 2018)。此外，LPS诱导的内皮细胞凋亡使得促使血栓形成的内皮下蛋白质暴露于各种凝血因素，进一步导致平衡向促凝状态发展(Seeley et al. 2012)。

LPS攻击或脓毒症发病后，心脏有可能出现功能障碍，表现为弥漫性和可逆性的射血分数下降同时伴有心室直径/容积扩大为特点的“顿抑”(Chagnon et al. 2005)，与心肌顺应性改变有关(Chagnon et al.2006)。显微镜下，可逆和不可逆性细胞病理性基本改变包括凋亡、灶性坏死、淤血、炎性浸润和水肿(Chagnon et al. 2006)。脓毒症时心脏功能损害有多种机制(Flesch et al. 1999)，尚未完全阐明(Yucel et al. 2017)。一项解释脓毒性心肌障碍的有争议的假说认为是冠脉血流不足(Chagnon et al. 2006)。事实上，一些动物研究已经证明注射内毒素会导致冠脉血流减少。另一方面，其他人报道脓毒症患者冠脉显著扩张并且冠脉血流甚至是增加的(Yucel et al. 2017)。此外，脓毒症性心肌病发病机制广泛涉及到了大量化学介质如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、白介素-1（IL-1）、一氧化氮和活性氧（ROS）(Chagnon et al. 2006; Yucel et al. 2017)。细胞凋亡似乎也起着重要作用(Chagnon et al. 2005; Lancel et al. 2005)。详细来说，内毒素不但能触发心脏多种天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（caspase）活化以及触发线粒体释放细胞色素C，从而导致心肌细胞终末期凋亡，而且caspase-3活化可能也直接引起肌丝对钙的反应发生改变、肌钙蛋白T裂解和肌节解体，但并不导致心肌细胞死亡(Lancel et al. 2005)。被低估的还有心肌壁水肿本身，在这种可逆性功能障碍时使得心肌顺应性和弹性发生改变(Chagnon et al. 2006)。

证据显示人多能干细胞经过LPS处理其动作电位持续时间延长，这可能一定程度上解释了为什么脓毒症患者心脏节律会频繁变化(Yucel et al. 2017)。

LPS输注常用于在不同种属制备急性肺损伤（ALI）模型(Waerhaug et al. 2008)。动物模型中，气管内滴入或者静脉输入1小时后能观察到大量组织出现损伤，其特征为肺泡和间质中性粒细胞集聚、肺泡壁增厚、蛋白水肿液集聚和肺泡内碎屑(Matute-Bello et al. 2011)。这些改变大多是由于大量血管渗出不仅导致液体和大分子进入间质和气腔，而且导致白细胞经内皮渗出进入肺组织，进而导致血管和肺泡功能障碍(Peng et al. 2004)。ALI的其他特点是微血栓形成(Proudfoot et al. 2011)和肺泡纤维蛋白沉积（由于凝血和炎症间存在广泛的交互作用），这可能会进一步加重肺损伤(Tuinman et al. 2012)。此外，Rodriguez-Gonzalez 等(2015)发现LPS诱导肺上皮细胞损伤所释放的炎性介质可能会导致发生脓毒症相关性脑病。

LPS诱导人急性肾损伤（AKI）的机制很复杂，并非是低灌注和缺血那么简单(Morrell et al. 2014a; Nakano et al. 2015)。对于肾脏，就像肺和心脏一样，肾小管上皮细胞（尤其是在近曲小管刷状缘顶端内）组成型表达TLR-4(Morrell et al. 2014a)。不过可惜，迄今为止，对TLR-4激活以及细胞间级联样信号启动后发生AKI的最终下游机制知之甚少(Morrell et al. 2014a)。最近一篇综述中，Morrell等(2014b)认为炎症通路可以导致小管转运功能障碍并伴有NaCl向致密斑转运增加，球管反馈增强，肾小球滤过率（GFR）下降。一项关于小鼠LPS诱导AKI的研究显示LPS通过一种依赖TLR-4的机制在近端小管细胞选择性集聚，开始就伴有肾小管流速下降，并在之后出现细胞肿胀和小管堵塞(Nakano et al. 2015)。此外，在脓毒症AKI的发病机制中凋亡起到作用已被提出，可能是通过肿瘤坏死因子受体1（TNFR1），这得到一项研究支持，研究显示TNFR1-/-相比TNFR1+/+的小鼠给予LPS后肾脏细胞凋亡较少并且肾脏中性粒细胞浸润较少(Cunningham et al. 2002)。但是，最近的一项研究显示LPS也能通过Fas介导（注：Fas／FasL作为可直接启动细胞凋亡的信号途径，是介导细胞凋亡最为重要的膜蛋白分子，Fas的英文全称为factor associated suicide，意即自杀相关因子。）和caspase介导途径直接导致肾小管细胞凋亡(Cantaluppi et al. 2008)。再者，LPS可以直接作用于肾脏固有细胞如足细胞和小管上皮细胞刺激炎性介质合成(Zurovsky et al. 1995)（图1B）。

内毒素与免疫系统

近十年间由于重症医学诊疗的进步，早期脓毒症病死率已经下降了。然而，晚期病死率是上升的。认为对长期死亡来说最重要的是脓毒症改变了固有和适应性免疫系统(Delano and Ward 2016)。

脓毒症实验模型已经广泛用于研究所谓的内毒素耐受，也就是对内毒素致死性作用的脱敏，在致死攻击剂量之前先给与诱导剂量（少量）的内毒素。这在人革兰氏阴性菌脓毒症也能发生(Opal 2007)。由于人脓毒症免疫麻痹概念要复杂得多，“内毒素耐受”显得过于简单化，这一概念不是那么简单地就能适用于人类，但是“内毒素耐受”的概念有助于明确脓毒症引起免疫系统改变及后果背后的机制。尽管最近已有假说认为单核细胞遗传外重新编程在单核细胞表型受抑起着重要作用，但脓毒症LPS耐受的潜在机制仍然不是很清楚(Delano and Ward 2016)。传导分子的核转位的改变、细胞因子基因信使RNA稳定性下降(Opal 2007)、以及两种Micro-RNAs[V1] （miR146和miR155）表达增强(Biswas and Lopez-Collazo 2009)都是免疫细胞基因重新编程所涉及的机制。

总之，LPS攻击后，单核细胞产生低水平的促炎因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12同时产生更多的抗炎因子。再者，由于MCH Ⅱ类分子（主要组织相容性复合物Ⅱ类分子）如人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）表达减少，单核细胞抗原递呈能力严重受损(Biswas and Lopez-Collazo 2009; Delano and Ward 2016)。需要注意，不仅单核细胞，而且树突状细胞、中性粒细胞、T细胞(Elyce 2011)以及自然杀伤细胞都参与到了免疫麻痹的发生(Delano and Ward 2016)。广泛存在的免疫细胞特定亚群细胞凋亡也起作用(Opal 2007) (图1B)。

治疗方法

Ziegler最早尝试抗内毒素治疗，1982年发表，自此以后，提出了一些清除内毒素的策略，从抑制内毒素合成的药物到对抗内毒素的疫苗或抗体。不幸的是，所有美国FDA的临床试验都失败了(Romaschin et al.2012)。因此，许多清除LPS的血液净化技术最近已开始应用，得到了与之前截然相反的结果。在第四版《拯救脓毒症运动指南》(Rhodes et al. 2017)中首次提到血液净化，但既不推荐也不反对(Ilia et al. 2017)。

一些用于体外血液净化的药柱已经研发成功，Toraymixin®（多粘菌素B通过共价结合粘附在组成吸附柱的聚苯乙烯纤维上）的清除能力最强研究也最多，迄今应用多粘菌素B（PMX-B）的三个大型随机对照研究却得出了相反的结果。ABDOMIX研究并未证明PMX血液灌流对腹膜炎引起的脓毒症休克患者的脏器衰竭和病死率有任何益处(Payen et al. 2015)，而腹腔感染的脓毒症休克早期多粘菌素B血液灌流研究（EUPHAS）报道脏器衰竭得以改善，并且降低了28天病死率(Cruz et al. 2009)。回顾性注册研究EUPHAS 2得出了同样的结果(Cutuli et al. 2016)。最后，评价多粘菌素B血液灌流治疗成人内毒素血症和脓毒症休克的随机对照研究（EUPHRATES）在2016年进行总结，采用安慰剂对照的多中心设盲设计(Klein et al. 2014)。目前就此仅有一篇声明称PMX血液灌流显著改善内毒素活性测定（EAA）水平在0.6-0.9且多脏器功能障碍评分＞9的患者的28天存活率是改善的，基于的是亚组分析结果。（注：EUPHRATES研究结果已经发表，JAMA. 2018 Oct 9;320(14):1455-1463.其结论是没有降低28天病死率；事后分析先期发表在Intensive Care Med. 2018 Nov 23.）

De Grooth 等(2018)声称，研究间明显的异质性限制了脓毒症休克研究的可复制性和可推广性并且可能妨碍发现对特点（亚组）人群有益的治疗。

结论

脓毒症和脓毒症休克死亡风险仍然高企，并且内毒素可能是最重要的炎症反应触发机制。尽管迄今为止免疫系统和内毒素复杂的交互作用尚未阐明，但可以明确的是高水平内毒素血症与重症患者的高死亡率和脏器功能障碍密切相关。

尽管多粘菌素B血液灌流可以作为源于内毒素的脓毒症休克治疗无反应时的补充治疗策略，但体外血液净化技术对脓毒症和脓毒症休克的临床疗效还不确切。

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