药物性肝损伤的实验诊断
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药物性肝损伤的实验诊断
药物性肝损伤（drug-induced live injury，DILI）药物本身或其代谢产物通过各种机制导致的肝脏损害，是常见的药物不良反应之一，也是新药撤市的主要原因之一。虽然DILI总体发病率不高，但是可以造成严重的不良结局，甚至导致患者死亡。在欧美国家，DILI已成为急性肝衰竭的主要原因[1]。
鉴于DILI发病机制复杂、临床表型多样，DILI的诊断仍是困扰临床医生面临的一个难题。在临床实践中，尚没有一种可靠的生物志记物或相对客观、特异的诊断方法可以明确诊断DILI。目前诊断DILI仍然依靠明确的用药史、血清学生物化学特点、停药后肝损伤恢复状态以及排除其他肝损伤病因等。疑似药物再刺激可以作为诊断DILI的"金标准"，但是可能导致严重不良结局，甚至患者死亡，因此在临床中并不推荐使用[2]。基于此，本文对目前现有的关于DILI的诊断方法进行综述。
一、评分量表
RUCAM量表仍被认为是目前可靠的DILI诊断工具。RUCAM量表将DILI分为肝细胞损伤性和胆汁淤积或混合型，最高评分为15分，≥6分可考虑DILI[3]。RUCAM量表具有实用性广、结构完整、易于理解以及相对合理客观等优点，但RUCAM量表对再用药权重过大，可重复性较低，不适用于诊断慢性DILI，当患者伴有其他基础性肝病时，RUCAM量表诊断DILI的特异度降低[4]，因此不应作为诊断DILI的唯一工具。
2003年，美国DILIN网设计了一个结构化专家诊断程序（SEOP）用于诊断DILI。与RUCAM量表相比，SEOP诊断DILI的准确率更高、可重复性更强，被认为是诊断DILI的"金标准"。但是，SEOP需要3位独立的肝病专家进行独立打分，诊断程序较为繁琐，临床实用性不强，不易推广。因此，当DILI诊断不明确时，可以使用SEOP进一步判断。
二、血清生物标志物
1．蛋白质型生物标志物：
目前，有许多诊断DILI的新型蛋白质型生物标志物得以研究，其中，谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）是最具应用前景的标志物之一。GLDH是氨基酸代谢和尿素代谢的关键酶之一，主要存在于肝细胞线粒体基质内，具有较高的肝脏特异性。GLDH升高往往出现在丙氨酸转氨酶（ALT）升高之前，提示GLDH可以作为早期肝损伤的生物标志物。同时，GLDH对DILI患者的预后有一定的预测价值，GLDH升高可能预示着DILI患者有较高的可能性发生急性肝衰竭（acute liver disease，ALF）[5]。此外，由于GLDH在肌肉组织中含量不高，GLDH有助于鉴别ALT升高是来源于肝损伤或肌肉损伤[6]。
高迁移率组蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，广泛分布于各个组织器官，参与基因转录、核小体组装以及DNA的损伤修复等[7]，在DILI新生标志物的研究中越来越受到重视。炎症反应时，HMGB1乙酰化生成乙酰化MHGB1(acHMGB1)并释放入血，外周血acHMGB1升高[8]，可作为炎症反应指标之一。HMGB1诊断DILI的阳性预测值不高，仅50%左右，但具有较高的阴性预测值，可达90%以上。因此，HMGB1正常有助于排除DILI[9]。
细胞角蛋白18（cytokeratin 18，K18）是肝细胞骨架结构蛋白之一，在维持细胞结构完整性起重要作用。肝细胞凋亡时，K18被Caspases酶降解为ccK18(caspase cleaved cytokeratin 18)。因此，ccK18/K18可以在一定程度上反映肝细胞的凋亡水平。有研究显示，在对乙酰氨基酚诱导的DILI中，外周血K18和ccK18同时升高[10]，并且K18的升高幅度大于ccK18[6]，提示肝细胞变性坏死是DILI的主要发病机制。同时，K18和ccK18在一定程度上可以预测DILI患者的结局。由于ccK18是细胞凋亡的标志之一，因此ccK18升高往往预示DILI患者有较好的临床结局。但是，K18和ccK18诊断DILI的特异性不高，在其他类型的肝损伤中，如非酒精性脂肪肝，也会升高[11]。
其他DILI新型生物标志物，包括苹果酸脱氢酶、穿透素-3等仍处于研究阶段。虽然欧美也发文支持DILI新型生物标志物的研发，但是，此类生物标志物的诊断DILI的灵敏度和特异度仍不高，不能满足临床的需求，有必要开发其他类型生物标志物。
2．miRNA生物标志物：
肝细胞损伤时，肝细胞内的部分微小RNA（miRNA）释放入血，使血中miRNA发生变化，因此外周血miRNA有望成为诊断DILI生物标志物。Russo等[12]纳入78例不同药物引起的DILI，并筛选了外周血3 000余种miRNA，发现和正常对照组比较，其中11种miRNA的变化差异有统计学意义，并且miR-122，miR-4463和pre-miR-4270的变化可以预测患者6个月内死亡情况，提示miRNA不仅具有潜在的临床诊断价值，而且具有一定程度的预后判断价值。
miRNA-122是目前研究最为广泛，且最具有临床应用潜力的miRNA。外周血内70%的miRNA-122来源于肝脏，因此认为miRAN-122具有较高的肝脏特异性。不同肝脏疾病状态，血清miRNA-122表达不同，如病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、DILI时血清miRNA-122升高，而肝细胞肿瘤、肝硬化时miRNA-122表达下降[13]，推测miRNA-122可能反应了肝细胞的再生状态。新近有研究显示，miRNA-122诊断DILI的灵敏度和特异度高于其他标志物，如K18、GLDH等[9]。
其他相关研究探索miRNA用于DILI诊断与预后的价值，如miR-124、miR-144、miR-22、miR-192等[14]，但这些miRNA与DILI的相关性仍不清楚,需要进一步研究以明确其与DILI的关系。
三、基因型标志物
近年来，随着二代测序技术的快速发展及广泛应用，基因组范围内的遗传标志物与DILI之间的关联研究快速发展，许多新的DILI风险基因得以发现，主要集中在人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）基因多态性、药物代谢酶相关基因多态性，以及其他相关基因，包括N-乙酰基转移酶（N-acetyltransferase 2，NAT2）、ATP结合盒转运蛋白2（ABCC2）基因等。
1．HLA基因多态性：
HLA基因多态性被认为是DILI的重要原因之一。新近一项研究纳入15例多种族特比萘芬相关性DILI患者，采用GWAS的研究方法，结果显示HLA-A*33:01基因与特比萘芬相关性DILI强相关[15]。然而，HLA-A*33:01并非特比萘芬相关性DILI特有的风险基因。最近一项纳入800例不同药物引起的DILI患者进行GWAS分析，发现HLA-A*33:01等位基因与多种结构互不相同的药物诱发的DILI强相关，如非诺贝特、噻氯匹定[16]。但是，Urban等[17]对783例欧洲裔的DILI患者，涉及200多种不同的药物，进行GWAS分析，并未发现一个共同的风险基因，提示某个基因多态性可能针对某一特定药物起作用，为今后DILI基因多态性研究明确了方向。目前已发现多个HLA基因多态性与DILI相关，如HLA-A*02:01与阿莫西林/克拉维酸钾相关、HLA-B*57:01与氟氯西林相关等。随着全基因组关联研究的广泛应用，越来越多的新的DILI风险基因得以发现。
2．CYP450基因多态性：
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）在药物代谢中起重要作用。不同CYP同工酶在药物代谢中起不同作用，其中CYP3A4同工酶约占人肝脏CYP的30%～40%，可代谢45%～60%的药物。最近，Chen等[18]纳入89例抗结核药物引起肝损伤的汉族患者，采用巢式病例对照研究证实CYP7A1基因多态性与汉族人ATDH相关。CYP7A1基因编码胆固醇7α-羟化酶，催化胆固醇分解为胆汁酸，胆汁酸在脂质代谢或亲脂性物质代谢中起重要作用，而抗结核药物多为脂溶性物质，因此，7α羟化酶活性减弱势必导致抗结核药在肝脏内蓄积，从而诱发肝损伤。CYP其他家族成员在DILI中也有重要作用。Singla报道CYP2E1*5B杂合基因可增加抗结核药物肝毒性[19]。一项Meta分析显示CYP2E1 c1/c1增加抗结核药物肝毒性[20]。总之，CYP基因多态性在DILI中起重要作用。
3．其他相关基因多态性：
其他一些基因多态性在DILI的发生中也可能起一定作用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因（UGT）1亚型A6和A7在APAP醛酸化中起重要作用，因此UGT1A6和1A7基因突变患者往往对APAP相关性DILI易感，而NAT2基因变异则是异烟肼肝毒性的另一原因之一。
因此，检测某种基因型指导药物的个体化使用，可以减轻其不良反应，在临床实践中有重要意义。
四、体外细胞模型
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）是外周血中具有单个核细胞的总称，包括淋巴细胞和单核细胞。PBMC属于一种具有定向分化潜能的干细胞，在一定条件下，可以诱导分化为肝样细胞，称为单核细胞衍生的肝样细胞（monocyte-derived hepatocyte-like cell，MH细胞）。有研究证实，MH细胞具有肝细胞的大部分特性，如细胞受损时ALT，LDH升高，三羧酸循环，表达细胞色素P450，产生凝血因子，以及对肝毒性药物易感等[21]，因此在一定条件下，MH细胞可以替代原代肝细胞成为研究DILI的有力工具。Dragoi等采用蛋白质组学技术分析MH细胞，筛选出整合素β3可以作为双氯芬酸诱导的肝损伤的特异性标志物[22]。Benesic等[23]认为MH细胞刺激实验诊断DILI的灵敏度不低于RUCAM，而特异度高于RUCAM量表。Benesic等[24]采用聚蔗糖梯度离心法提取DILI患者外周血PBMC细胞，体外培养诱导分化为MH细胞，然后用临床可疑药物再刺激，结果表明MH细胞刺激实验对DILI可疑药物进行溯源的灵敏度和特异度可达92.3%和100%。因此，体外刺激MH细胞可能为诊断DILI提供一种新的思路。
五、计算机模拟预测
1．Hy’s法则：
Hy’s法则是目前新药研发过程中评估药物肝毒性的主要参考指标之一，也是美国食品药品监督管理局终止药物试验的金标准。但是，Hy’s法则无法鉴别受试者ALT和总胆红素的升高是致命性的病理生理过程，还是可逆性的、一过性的升高。因此，仅根据Hy’s法则中止一项临床研究可能会阻碍新药的研发进程。
2．DILIsym：
DILIsym是一种基于定量系统药理学（quantitative systems pharmacology，QSP）构建的数学模型，它可以同时纳入DILI传统生物标志物和新型生物标志物在特定环境下模拟药物的肝毒性发病机制，预测药物的肝毒性[25]。DILIsym的优势是可以鉴别对于符合Hy’s法则的受试者，ALT和总胆红素升高是病理性的、不可逆的，还是良性的、一过性的。新近，一种治疗心力衰竭的新型药物cimaglermin-α在临床试验中因有2例患者出现肝损伤满足Hy’s法则而被终止。Longo等[26]采用DILIsym模型对这2例肝损伤患者进行评估，认为这2例患者肝损伤的主要机制是肝细胞凋亡，并且肝细胞损伤数< 13%，继续用药不至于引起严重的肝功能不全。此外，DILIsym模型可以探索适应性免疫在特异质性DILI发病机制中的作用[27]。
3．其他：
其他基于机器学习建立的预测模型应用于新药研发过程中DILI严重程度的评估，以发现新的生物标志物及DILI的发病研究。Hong等[28]采用决策树算法开发一种新的计算机预测模型，该模型将药物分为三类，即most-DILI、Less-DILI和non-DILI，发现该三分类模型可以更好地识别肝毒性药物。最近，Chen等[29]根据口服药物的亲脂性、每日剂量以及活性代谢产物建立了一个可以预测口服药物肝毒性严重程度的新型预测模型，纳入4个临床研究的原始数据证实DILI评分≥7有较大的可能导致严重肝损伤。因此计算机预测模型建立为DILI的相关研究提供了一种新的思路。
六、展望
近年来，关于DILI的实验室诊断方法已取得不少进展。但是，无论是新型生物标志物，还是体外细胞模型都未能取代传统生物标志物，只是作为传统生物标志物诊断DILI的补充。随着蛋白质组学、代谢组学的快速发展，新型生物标志物的研究已突破技术方面的限制，缺乏完整信息的样本库、诊断方法的特异性不高以及相关发病机制不明等是目前DILI研究的主要障碍。尤其在国内，大部分DILI由中药制剂引起，中药制剂成分复杂、多样使中药相关性DILI研究进展缓慢。因此，建立具有完整信息的DILI样本库将是DILI研究的重要任务之一，国外DILIN网站，以及国内已建立的DILI专业网站"Hepatox"，将对DILI研究提供重要线索。
引用: 李虎, 陈立, 张欣欣. 药物性肝损伤实验诊断研究进展 [J] . 中华肝脏病杂志,2020,28 (06): 536-539.
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