非小细胞肺癌细针穿刺细胞学标本基因检测专家共识
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非小细胞肺癌细针穿刺细胞学标本基因检测专家共识
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是原发性肺癌的主要类型，占总数的80%~85%［ 1 ］，大部分患者就诊时已到晚期，手术治疗不能获益且预后差。近来，中国NSCLC分子病理检测临床实践指南和专家共识的发表，给国内一线临床工作者深刻理解靶向治疗肺癌指明了方向［ 2 , 3 ］。作为主要治疗手段的传统化疗对进展期NSCLC患者的疗效已达到最大化［ 4 ］，以基因变异为治疗依据的靶向治疗给这类患者带来了新的曙光，可明显提高患者治疗的客观缓解率和延长无进展生存时间（PFS），无论是术后患者或是晚期无法手术患者均可获得明显的疗效［ 5 , 6 ］。然而，并非所有需要靶向治疗的病例都能获得所需的组织病理学标本。经支气管镜细针穿刺（transbronchial needle aspiration，TBNA）、锁骨上淋巴结转移的细针穿刺以及某些CT引导下经皮的细针穿刺所获得的细胞学标本是基因检测顺利完成的另一途径，实践证明具有重要的临床应用价值和广泛的临床应用前景。本共识总结NSCLC细针穿刺细胞学标本基因检测常用方法，以指导和规范其在此类肿瘤诊疗中的应用。
一、细针穿刺获取细胞学标本进行基因检测的临床意义
目前国内外采用的细针多指针头外径在23 G以内，一般选用针头外径21~22 G，这样才能保证细针吸取的安全性，针的细度足以确保不会因为微小的损伤而引起肿瘤细胞的扩散和转移，相反针头外径也不能过小，针头过细不能保证获取足够的细胞成分。
与组织活检相比，细针穿刺具有较多的优点：（1）操作简单易行，无需特殊设备；患者痛苦少，无瘢痕形成。（2）本方法是一种微创技术，操作安全，大量文献报道和临床实践结果表明极少发生不良反应［ 7 , 8 ］。（3）取样迅速，制片、诊断亦较快，一般只需1 h左右，故可用于手术中的病理诊断。（4）应用范围广，几乎适用于任何部位，其他方法很难取得标本的部位，本法亦能取到。对同一肿物可作多个点穿刺；可重复检查，便于动态观察或疗效观察。（5）所获得的细胞完全是新鲜的，无自溶变性，很少人为挤压，细胞舒展，无组织切片的人为收缩，有利于镜下观察，细胞培养、免疫细胞化学染色及基因检测等先进的检测方法，在科研及临床工作中具有重要的临床意义。
二、肺癌细针穿刺细胞学标本的常见类型
1.TBNA：是同一支气管镜程序下诊断肺癌的常用方法之一，也是对活检方法的重要补充［ 9 ］。活检经常受到某些病变部位的限制，如远端支气管病变、支气管外周型病变以及肺门周围淋巴结病变，所获取的标本是癌旁组织，导致假阴性结果。而TBNA及支气管内超声引导下经支气管针吸活检术（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）是一种微创的诊断技术，操作过程中既安全又直观，可获取丰富的细胞成分，提高肺腺癌的诊断率［ 10 , 11 ］，几乎适用于所有部位发生的病变。
2.淋巴结转移的细针穿刺：晚期肺癌发生体表淋巴结转移，通过细针穿刺可以获取丰富的肿瘤细胞进行有效的基因检测。其中左侧锁骨上淋巴结尤为常见，相当数量的肺癌患者首诊的症状是锁骨上淋巴结肿大。此部位淋巴结距离附近大血管和胸膜较近，通过活检术获取标本非常容易刺破大血管或胸膜，造成大出血或气胸，这类并发症已在临床上出现过惨痛的教训。为了避免出现这样的并发症，临床上首选淋巴结细针穿刺术，为细胞学诊断及基因检测提供丰富的细胞成分。
3.超声或CT引导下经皮的细针穿刺：病变靠近胸壁者可在超声引导下针吸穿刺或活检；病变不紧贴胸壁时，可在透视或CT引导下针吸穿刺或活检。为提高诊断率，可重复检查。经皮针吸活检检查的常见并发症是气胸，为了安全起见，避免并发症的发生，一些医院将针吸穿刺替代针吸活检。
三、适用于细针穿刺标本的肺癌基因检测常用方法
肺癌的基因检测方法较多，临床常用的包括针对蛋白表达的免疫细胞化学技术（ICC），针对基因突变的Sanger直接测序法、突变扩增阻滞系统（ARMS-PCR），针对基因融合和基因拷贝数检测的染色体荧光原位杂交（FISH）技术，检测基因表达水平的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，以及能够满足上述各种检测要求的二代测序（next-generation sequencing）技术等。这些用于临床基因检测的各种方法，均可用于肺癌细针穿刺标本的检测［ 12 , 13 , 14 , 15 ］。
免疫细胞化学的检测对象是特定的某种蛋白质的表达水平，可以用于检测肺癌样本的ALK融合蛋白、ROS1、PD-L1蛋白的表达水平等，以便指导临床进行靶向治疗或免疫治疗。Sanger直接测序法、ARMS-PCR、RT-PCR技术都是基于PCR的检测技术。Sanger直接测序法和ARMS-PCR是针对基因突变或插入/缺失进行检测，可用于EGFR、RAS、RET、MET和BRAF等基因热点突变的检测，而RT-PCR技术是针对基因表达水平（RNA）进行检测，可以用于ALK融合基因、ROS1融合基因的检测。FISH是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息［ 16 ］，可以用于ALK融合基因、ROS1融合基因的检测。二代测序技术，又称为“高通量测序”，不仅可以一次性检测数百上千个基因，能发现未知的、罕见的基因突变，而且灵敏度高，极低水平的基因异常也可以检测出来。二代测序在基因检测中的地位越来越高，除了点突变，也可以检测基因易位，同时可以检测ALK、ROS1、EGFR、KRAS、MET等几个乃至几百个基因。
四、采用细针穿刺所得细胞学标本进行基因检测的优点及正确评价
与组织蜡块标本相比，细胞学细针穿刺所得到的标本是新鲜活体细胞样本，直接固定在细胞保存液中，这些新鲜样本没有遭受人为的挤压、牵拉及高温处理，其DNA和RNA完整性好，几乎无丢失，即使总量较低，也能很好的被扩增，适合DNA水平，特别适合RNA水平的检测。这方面的检测经验在前期工作中已得到了充分的证实［ 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ］。特别是需要使用高通量的联合检测技术如多基因联检的PCR或二代测序技术，一次能检测所需检查的所有基因突变，避免多次检测导致样本不足错失靶向治疗的机会。值得注意的是，通常只有在无法获得组织学标本的情况下才利用细胞学标本进行基因检测。另外，细针穿刺所获得的细胞学标本多数不是原发灶，而是转移癌标本，其基因检测结果是否与组织学原发灶结果完全一致尚有待于今后更深入的研究和证实。最后，细胞学标本在检测前也必须对肿瘤细胞数量和质量进行评估，应用涂片进行FISH检测时需在载玻片反面标记肿瘤细胞所在区域，这样可以准确标记肿瘤细胞，获得满意的检测结果。
五、标本的前期处理及质量评估
细胞学穿刺标本与组织学标本一样，进行基因检测的前提是细胞学诊断明确。尽管可以提供高质量的核酸，但影响分子检测结果的因素众多，涉及检测过程中的各个环节，做好这些质控，可以最大效能地发挥细胞学穿刺标本在基因检测中的价值，其具体操作步骤见流程 图1 .
细胞学穿刺标本在基因检测中操作步骤流程图
1.细胞涂片用于肺癌靶向基因检测：细胞涂片用于FISH技术检测具有重要的临床应用价值。细胞涂片上肿瘤细胞的数量>100个，载玻片反面标记肿瘤细胞区域，轻轻移去盖玻片，同组织FISH操作流程一样，仅仅在消化时间上少于组织学样本。细胞涂片用于FISH检测的优势是细胞新鲜、完整，容易被消化，无纤维类组织结构和杂质，背景清晰。需要注意的是，制作涂片必须保证细胞分布均匀，既不能重叠也不能间距过大，以便保证判读容易并准确［ 17 ］。
2.剩余液基细胞学样本用于肺癌靶向基因检测：将诊断后剩余的液基细胞学样本转移至15 mL离心管后，3 000转/s，离心5 min，弃去上清，将沉淀转至1.5 mL离心管中，用于核酸提取。这种检测方法保存了完整的核酸序列，更适合于DNA或RNA检测，即使是标本量很少也可以获得非常满意的结果。上海市肺科医院吴伟等［ 21 ］综合液基细胞涂片上肿瘤细胞数量和剩余液基沉淀大小两个因素，建立了剩余液基细胞标本分子检测前的完成评估体系。
3.细胞包埋块样本用于肺癌靶向基因检测：细针穿刺细胞学标本如果标本量比较多，也可以制作成包埋蜡块，便于长期保存。用于分子检测的质控要求和小活检组织类似，需要评估肿瘤细胞的含量和数量，当肿瘤细胞含量≥20%时可以用于PCR或二代测序检测；当肿瘤细胞含量低于20%的时候，但肿瘤细胞数量≥200个，可以刮片富集肿瘤细胞进行后续分子检测。
本共识重点论述了NSCLC细针穿刺细胞学标本基因检测的必要性和可行性，尤其是获取细胞学穿刺标本的适用人群，采用细胞学穿刺标本进行基因检测的优缺点以及检测过程中的技术难点及注意事项。本共识的完成希望对国内各级医院应用细胞学穿刺标本进行基因检测提供科学理论和临床实践经验，也将为NSCLC的基因检测及靶向治疗的广泛普及产生一定的促进作用，为部分晚期NSCLC患者带来新的曙光。
引用：中华医学会病理学分会细胞病理学组. 非小细胞肺癌细针穿刺细胞学标本基因检测专家共识[J]. 中华病理学杂志,2022,51:(09)：828-831.
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