脓毒症实验诊断现状与问题
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脓毒症是机体对感染反应失调导致自身组织和器官损伤，危及生命的疾病。如果不及早识别并及时处理，可能发生感染性休克、多器官功能衰竭和死亡。脓毒症通常由细菌感染所致，也可能是病毒、寄生虫或真菌感染的结果，是许多感染性疾病的共同死亡途径。脓毒症的流行病学负担难以准确估计，据报道，全球每年新增脓毒症患者达5 000万例，病死率为20%，每年可致1 000万例死亡［1, 2, 3］。围绕脓毒症，全球已开展数百项临床试验，仍无一种单一的治疗方法能提高脓毒症患者的生存率［2］。
早期识别症状并及时开展适当的临床管理是降低脓毒症风险和影响的关键。感染病原体种类、宿主免疫反应失衡，以及凝血功能异常导致的器官功能障碍，是影响脓毒症预后的重要因素。因此，病原学快速诊断、免疫状态精准评估、凝血功能异常和器官功能障碍早期发现，成为脓毒症患者临床管理最重要的实验诊断问题。近年来，随着分子生物学、免疫学检验技术的发展，以及机器学习等分析手段在临床上的探索性应用，让大家看到解决以上问题的曙光。例如，利用极速PCR技术快速明确病原体种类及耐药性，利用多参数流式细胞仪绘制脓毒症免疫图谱并结合机器学习对患者进行分型，以及使用黏弹性试验、凝血激活分子标志物、内皮损伤分子标志物等非常规指标进行早期凝血障碍诊断，无论对脓毒症早期诊断，还是预后判断均具有重要的临床价值。基于此，本期刊策划脓毒症实验诊断专刊，讨论脓毒症实验诊断的现状与问题。希望加强读者对脓毒症实验诊断的关注，以期提高脓毒症临床管理水平，为改善患者预后提供帮助。
尽早启动有效的抗感染治疗对于改善脓毒症患者预后至关重要。近年来，传统技术的改进、传统技术与分子技术的结合，以及不依赖培养的新技术开发，缩短了病原学报告时间、提高了检测效率。
虽然传统的血培养技术存在检测周期长，易受抗菌药物使用或采集规范化（如采血量、采集次数和套数）的影响，病原谱窄，不能检测病毒、寄生虫及难培养病原体等局限性，因其能够提供细菌和真菌鉴定和抗微生物药物敏感性试验结果，依然是血流感染主要的病原学诊断方法。一直以来，学者们致力于推动血培养从项目选择、患者准备、标本采集和运送规范化，到阳性血培养直接显微镜检查、危急值报告，以提高检测阳性率，缩短报告时间，为脓毒症患者调整治疗方案提供依据。2019年欧洲临床微生物和感染病学会欧洲药敏试验委员会建立了大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌、鲍曼不动杆菌阳性血培养直接快速抗微生物药物敏感性试验，根据菌种和孵育时间相应的判断标准，4、6、8或16~20 h（2022年增加）报告药敏试验结果，缩短了这些菌种-药物的药敏试验结果报告时间。
在传统培养技术与分子技术相结合，提高病原学检测效率方面已有成熟的产品问世。快速诊断微生物学领域依赖于微生物特异性蛋白质（如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法）或核酸（如多重聚合酶链反应、微阵列和基于探针的荧光显微镜）检测。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定技术已在临床逐步普及，用于鉴定阳性血培养转种后培养基上过夜生长的菌落。通过对阳性血培养直接检测或转种固体培养基短时培养后快速鉴定，使阳性血培养鉴定和药敏试验结果报告时间由2~4 d缩短至24 h以内。虽然这两种快速鉴定方法均不能可靠地检测混合感染，但因血培养一种以上病原体生长的情况少见，不失为缩短报告时间的有效方法。特别是传统血培养结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱快速鉴定和快速抗微生物药物敏感性试验，显著缩短了血培养报告时间。多重PCR、微阵列和探针荧光显微镜等核酸检测技术可以在1~4 h内从阳性血培养中鉴定特定的病原体及耐药基因。例如基于多重PCR的BioFire FilmArray系统，其第二代血流感染鉴定产品，约1小时可报告阳性血培养瓶中26种/属细菌、7种真菌和10种耐药基因。检测敏感度和特异度均在90%以上［3］。Luminex Verigene全自动多病原芯片检测系统使用磁珠捕获细菌DNA，约2.5 h可报告阳性血培养瓶中22种/属细菌、8种抗菌药物耐药基因。Accelerate Pheno系统分别通过荧光原位杂交方法和延时自动显微镜实现快速鉴定和快速药敏表型检测，是目前唯一可用的结合快速鉴定和快速检测几种抗菌药物最小抑菌浓度的表型抗微生物药物敏感性试验平台。该系统所检测的病原体种类不多，但其通用探针可提示组套以外的病原体存在，以便通过传统培养技术进一步鉴定。研究显示，Accelerate Pheno系统与金标准肉汤微量稀释法相比，抗菌药物敏感性分类一致率为91.2%~95.5%。与传统血培养相比，鉴定时间减少23~41 h，抗菌药物敏感性报告时间减少了40~48 h［4］。
血培养诊断脓毒症灵敏度仅30%~50%［4］。近年来开发的多种不依赖于培养的病原学快检技术，如核酸扩增、基因测序等，试图弥补血培养的不足，应用于急危重症患者。数字PCR技术，可以对标本中游离核酸进行绝对定量，1~6 h内靶向检测数十种常见病原体及耐药基因。通过对病原体核酸负荷的监测，可以辅助临床抗菌药物的使用以及预后判断［5, 6］。纳米孔测序技术，可以实现单分子测序，无须进行PCR扩增，检测绝大多数病原体和耐药基因［7］。宏基因组高通量测序技术可直接检测血液标本中游离DNA，3~12 h完成检测［8］。然而，快检技术存在易受环境病原菌污染、检测费用高、需要专门的仪器和试剂、难以提供抗微生物药物敏感性、结果解释困难等问题。除此之外，也有一些联合机器学习、传感器等开发的快检技术，但所检测的病原体种类有限［9］。王秀丽等［10］《重症监护病房床旁病原学快速诊断-快速现场微生物学评价》介绍了近年出现的快速现场微生物学评价技术。通过对气管镜检查获取的下呼吸道标本进行现场涂片、染色、显微镜检查，以期快速获得抗感染治疗线索。虽省去了标本运送时间，但因该技术基于标本直接显微镜检查，存在仅依据形态，通常难以鉴定病原体，无法获得药物敏感性结果等局限性，生物安全也面临挑战。
免疫失衡状态是脓毒症患者的显著特点，具体表现为患者同时存在高炎反应和免疫抑制状态［11］。究其原因，一些涉及清除病原体的保护机制，由于持续反应导致机体出现过度炎性状态而致病。例如，中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞持续作用，可释放大量促炎性细胞因子引起过度炎症反应［11］。用于脓毒症诊断的炎症指标有限。朱义玲［12］《血小板-单核细胞聚集物表达水平在脓毒症临床诊断中的价值》研究显示，血小板-单核细胞聚集物可能成为脓毒症诊断的生物标志物，但其临床价值有待进一步评估。脓毒症患者免疫失衡的另一表现为免疫抑制性细胞，如调节性T细胞和髓源抑制细胞，明显增高［13］。裴飞和吴健锋［14］《评价脓毒症免疫抑制生物标志物的四个标准》强调了免疫抑制是提示脓毒症患者预后不良的重要危险因素，而单核细胞人白细胞DR抗原作为代表性指标，在脓毒症免疫抑制患者识别、预后评估、病情分级、疗效监测四个方面均有一定应用价值。此外，抗炎性细胞因子如IL-10、PD-L1、IL-1ra等释放会加重免疫抑制状态，又称为代偿性抗炎反应综合征［15］。脓毒症患者存在以促炎因子、抗炎因子，以及抑制性免疫细胞同时增加为表现的免疫紊乱状态，是预示患者预后不良的重要特征。
值得注意的是，炎性反应和免疫抑制强度，以及免疫病理损伤，在脓毒症患者中具有广泛的异质性［16, 17］。免疫异质性是导致免疫调节剂治疗脓毒症无效的主要原因。目前认为，基于宿主免疫反应共有特征对患者进行分型，并在此基础上选择适当的免疫调节剂，是提高脓毒症免疫治疗疗效的重要途径［18］。近年来，许多研究者基于临床表现、实验室结果，以及转录组数据，使用机器学习和无监督聚类分析等手段成功区分不同型别脓毒症［19, 20］，希望以此为突破口改善脓毒症患者预后。
从脓毒症患者免疫特点来看，免疫状态评估在脓毒症实验诊断及治疗中发挥重要作用。该领域目前进展迅速，通过高通量细胞因子检测技术可以早期监测促炎和抑炎性细胞因子释放，通过多色流式细胞仪可以获取不同免疫细胞数量和表型特征，从而精准定位患者处于高炎、高抑炎，以及高炎合并免疫抑制失调状态，为脓毒症患者预后判断及免疫调节剂使用指明方向。
脓毒症患者可能出现包括凝血系统在内的多系统功能紊乱。据报道，约50%~70%的脓毒症患者存在凝血功能障碍，而其中发展为弥散性血管内凝血患者比例高达35%［21］。感染性疾病发病早期，凝血系统作为一种天然防御机制，可限制病原体播散至外周循环。当感染进展到中后期严重阶段，大量炎性细胞因子释放到循环中，导致凝血过度激活、纤溶受损及抗凝途径抑制，患者出现以血栓事件为主的高凝血症。同时，凝血物质的大量消耗又可导致以出血为主的低凝血症，造成复杂的凝血功能紊乱［22］。如何利用实验室指标识别脓毒症凝血紊乱的发生和发展是当前的热点话题。宋景春［23］《脓毒症性凝血功能紊乱的精准识别》描述了脓毒症性凝血功能紊乱的时相特征与实验室监测指标，介绍了国际血栓与止血学会发布的脓毒症性凝血病评分标准［24］，建议充分利用黏弹力试验联合凝血分子标志物的检验方法，连续、动态监测脓毒症性凝血功能紊乱。文章系统分析了凝血检测指标在脓毒症不同时相的变化，为临床利用这些指标精准识别凝血功能紊乱，继而给予相应的抗凝和替代治疗提供了重要参考。
脓毒症治疗的重要原则是快速、有效的临床管理。尽管脓毒症实验诊断近年来取得了一定进展，但仍面临以下难题：（1）理想状态下有效的抗感染治疗应在脓毒症识别后1 h内进行［25］。然而，传统培养技术及表型药敏试验结果滞后，不能满足临床初始针对性抗感染治疗的需要。虽然传统培养技术结合分子技术、不依赖培养的新技术可能通过更快速地识别重要病原体和检测常见耐药性改善临床管理，但是，目前可用的快速诊断技术无法全面地识别可能导致血流感染的各种病原体，以及全面的药物敏感性结果。耐药性导致经验性选择抗感染药物面临挑战。（2）脓毒症免疫分型有助于解释患者异质性，但仍需要进一步研究，以确定亚组分类在临床治疗中的确切效果。由于缺乏从病原感染开始到重症器官功能障碍纵向免疫数据分析，脓毒症发病过程中各阶段的免疫状态及转归仍不明确。（3）研究证实，越来越多的凝血分子标志物，特别是反映凝血激活和纤溶抑制的标志物，有助于脓毒症弥散性血管内凝血的识别及结局预测［26］。然而，这些标志物是否能够指导脓毒症性凝血紊乱的处置，改善患者预后，有待高质量前瞻性、干预性临床研究予以确认。总体而言，理想的脓毒症诊断试验应具备快速（3 h内）、检测病原谱广且病原体载量浓度范围宽、所需标本量小、灵敏、易于操作、易拓展检测未知病原体、提供病原体耐药性结果、具有区分炎症反应是由宿主还是病原体驱动所致的能力等特点。目前，尚无满足以上性能的产品。
引用：汪峰, 唐宁, 田磊, 等. 脓毒症实验诊断现状与问题[J]. 中华检验医学杂志, 2023, 46(10): 983-986.
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