自身抗体检测的规范化及实践
自身免疫病（autoimmune disease，AID）是机体自身免疫异常引起的一类异质性疾病，包括器官特异性AID和系统性AID。AID的临床表现具有广泛性、复杂性。尤其是系统性AID可累及机体各部位，几乎可涉及各临床专科，给临床诊疗带来困难。因此，临床上需要对相关的生物标志物进行检测，而自身抗体作为AID最具有特征性的生物标志物，对AID的诊断、风险评估、预后及疾病管理等具有重要的临床意义［1］。
目前，随着自身抗体检测的临床应用越来越广泛，如何制定自身抗体检测的标准化和规范化显得尤为重要。由于自身抗体检测的复杂性和特殊性，标准化往往难以完全实现并遇到诸多挑战，而规范化切实可行且不断被重视，但其涉及到自身抗体检测的各个过程、多个方面［2, 3］。对此，现结合国内外近年来发布的相关自身抗体检测的临床应用共识及其实践，探讨自身抗体检测的规范化。
一、自身抗体检测临床应用存在的主要问题
随着自身抗体的临床推广应用，自身抗体检测的标准化和规范化成为AID实验诊断领域的主要问题。在自身抗体检测的实践中，存在不同实验室、技术方法、生产厂家及批次间检测结果的不一致。若某些自身抗体检测结果量值的改变，作为疾病活动度、预后评估等监测指标，检测结果的不一致可能会对患者的临床决策产生影响。
在临床研究、调查分析中亦发现，自身抗体检测结果存在不一致。一项在临床药物试验的103例系统性红斑狼疮患者中检测抗核抗体（ANA），采用间接免疫荧光法（IIF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、基于微球的多重检测方法（bead-based multiplex assay），其中IIF采用了3个不同厂家生产的检测试剂，结果显示，不同检测方法、检测试剂其ANA的检测结果不同［4］。欧洲自身免疫标准化促进会（EASI）对12个欧洲国家、1 200个实验室的ANA及其特异性自身抗体的检测方法、结果解释及检测程序进行调查，结果显示，IIF检测ANA的滴度、荧光模型、ANA相关特异性自身抗体的检测方法、抗双链DNA抗体的检测方法和报告、ANA检测程序，在不同国家甚至同一国家不同实验室间存在差异［5］。对此，2014年EASI和自身抗体标准化委员会（ASC）共同发表了25条“抗核抗体检测的国际建议”［6］，目的在于规范ANA及其特异性自身抗体的检测及临床意义。另外，由EASI组织的12个国家429个实验室，调查抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）的检测，结果显示，不同实验室间对ANCA检测情况有较大的差别，如IIF检测ANCA使用不同的实验室基质，其中77.9%的实验室使用乙醇固定的中性粒细胞，66.2%的实验室使用甲醛固定的中性粒细胞。抗髓过氧化物酶（MPO）抗体、抗蛋白酶3（PR3）抗体使用不同的检测方法，即使ANCA检测程序遵循国际共识亦存在差异［7］。在国内，由国家风湿病中心（CRDC）组织的关于IIF检测ANCA荧光模型的判断网络调查发现，ANCA定性结果及荧光模型的判读存在明显差异。一项采用12种不同检测方法、检测试剂，对国内肉芽肿性多血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）患者进行ANCA检测的多中心研究评估显示，ANCA的不同检测方法、试剂存在不同的临床诊断性能［8］。对此，2019年中国免疫学会临床免疫学分会发表了关于“抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法在诊断肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎中应用的专家共识”，目的在于规范ANCA的检测方法，从而为临床提供准确的ANCA检测结果［9］。此外，其他自身抗体检测的临床研究、调查分析亦显示［10, 11, 12］，在不同的实验室采用不同的检测程序、不同的检测方法，对检测结果存在不同的解读及不同的检测截止值（cut off；阳性判断值）设置。目前，自身抗体检测主要存在标准化和规范化缺失的问题。
二、自身抗体检测的标准化、规范化现状
在实验诊断领域，标准化（standardisation）和规范化（harmonisation）这两个术语经常被相互使用，用来定义实验室结果在不同测量方法（条件）下具有的可比性，但基于溯源性原则有着不同的定义和要求［2，13, 14］。见表1。
对自身抗体检测的标准化，首先需要具有同质性、稳定性的标准物质。虽然有ASC、世界卫生组织（WHO）、参考物质和测量研究所（IRMM）等多个国际组织在推动自身抗体标准物质的研制，但由于其来源所限，目前仅有近30种常见的自身抗体标准物质。其主要来源包括：单一患者血液标本，不具有广泛的代表性，且来源有限。如1985年由WHO赋值为200 IU，来源于一位系统性红斑狼疮患者的抗双链DNA抗体标准物质（编码Wo/80）。此标准物质目前已经使用完，最近制备新的参考物质（标定值100U/ampoule，编码15/174），但与Wo/80无相关性，对抗双链DNA抗体检测起校准作用［15］。多个患者的混合血清标本，存在免疫学检测的干扰物质（如类风湿因子等），可采用亲和纯化方法制备可去除干扰物质。可针对多个抗原表位，提高各种自身抗体检测方法学间的可比性。另外，单克隆细胞培养的自身抗体标准物质，具有均一性，且不含有干扰物质，但不能代表患者来源的自身抗体特性。目前即使有自身抗体标准物质，但由于自身抗体自身不同的亲合力（高亲合力、低亲合力）、亚型（IgG、IgM、IgA等）、糖基化修饰等特征，针对不同的抗原表位（线性表位、空间构象表位），不同检测的方法学具有不同的性能特征，以及不同的生产工艺等，仍存在检测结果的不一致［2，16］。另外，自身抗体检测结果的国际单位较难进行验证获得，缺少标准方法作为参考。因此，自身抗体检测的标准化难以完全实现，相关自身抗体检测行业学会、组织已从标准化聚焦于规范化进程［2，17］。
自身抗体检测的规范化，在实验诊断领域中已经不断被强调，不仅包括传统的临床化学检验领域，亦应包括实验医学的其他领域，如临床免疫、临床血液、临床分子、临床微生物检验等。不仅强调检验中的规范化，亦包括检验前、检验后等检验全过程的规范化。为确保不同测量方法（条件）下，检测结果具有的可比性，规范化的目的在于对正确的患者在正确的时间选择正确的检测项目，以正确的形式提供正确的检测结果，提供正确的解释及正确的建议［18］。为实现自身抗体检测的规范化，可通过已达成的自身抗体检测专家建议、共识及指南等形式，结合医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189）等实验室体系［19］，进行自身抗体检测检验前的项目选择、患者准备、标本运送，检验中的检测方法、检测程序、结果报告、质量保证，检验后的结果解读、临床建议等规范。自身抗体检测规范化的基本特征，见表2。
三、自身抗体检测的规范化实践
3.抗磷脂抗体（aPLs）检测的规范化［26］：aPLs是一组以磷脂和/或磷脂结合蛋白为靶抗原的自身抗体总称。根据靶抗原的特性主要分为狼疮抗凝物（LA）、抗负电荷磷脂抗体、抗中性磷脂抗体、抗两性磷脂抗体、抗磷脂结合蛋白抗体。其中LA、抗心磷脂（aCL）-IgG型抗体、aCL-IgM型抗体、抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPⅠ）-IgG型抗体、抗β2GPⅠ-IgM型抗体已作为国际血栓与止血学会（ISTH）2006年修订的抗磷脂综合征（APS）分类标准中的实验室指标，应用于APS筛查与诊断。另外，aPLs检测亦可用于血栓及病理妊娠的风险评估。
LA的检测方法包括筛查试验、混合试验、确证试验，检测程序为筛查试验➝确证试验➝混合试验，当筛查试验和确证试验检测结果难以解释时再进行混合试验。LA的检测应在使用抗凝药物前或抗凝药物停用足够时间（至少1周）后采集血液标本。血液标本采集后应及时进行离心，以确保离心后血浆中的血小板计数小于10×109/L，确保凝血因子活性。LA混合试验（循环抗凝指数）和确证试验（纠正百分比、标准化比值）的检测结果，建议采用待测患者血浆与正常血浆的比值来表示，LA的检测结果除上述比值外，亦应有阴性、阳性的结果判断。建议使用非参数的百分位数方法建立截止值，推荐采用99的百分位数（99%），大于截止值判断为阳性。
aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体的检测，使用血清标本，避免热灭活和反复冻融、溶血及脂血标本。通常检测aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体的IgG和IgM亚型，若结果阴性但临床疑诊APS时，进一步检测IgA亚型。aCL抗体检测的靶抗原应包括心磷脂和β2GPⅠ，抗β2GPⅠ抗体检测的靶抗原应采用包括全部氨基酸序列区域（结构域Ⅰ~Ⅴ）的人源性β2GPⅠ。检测方法有ELISA、化学发光法（CLIA）等，自动化、定量检测是今后发展的必然趋势。检测结果采用国际单位，可促进检测结果在不同实验室、方法学间的一致性和可比性。使用多点定标，定标值与其预计值的相关系数应大于或等于0.90。检测结果变异系数（CV）应小于或等于10%，20%为最大可接受值。每批次检测时，建议使用阴性和阳性质控物进行质控，阳性质控至少要包括检测值接近截止值的质控物。定性检测使用非参数的百分位数方法建立截止值，推荐采用99的百分位数（99%）；定量检测可参照相关要求（如美国临床和实验室标准协会制定的EP28-a3c）建立，验证参考区间。检测结果报告中应包括检测方法、检测结果及单位。aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体的中高滴度检测结果通常为99的百分位数（99%）的2倍以上。
aPLs阳性不仅见于APS患者，亦可出现在其他AID、恶性肿瘤、感染性疾病、某些药物使用后及部分健康人群。接受华法林、肝素及新型口服抗凝剂治疗的患者可能出现LA假阳性，因此对其的LA检测结果，应谨慎解读。aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体检测通常包括IgG、IgM、IgA型。aCL-IgA型、抗β2GPⅠ-IgA型目前尚未纳入APS分类标准，单独aCL-IgA型、抗β2GPⅠ-IgA型中高滴度阳性较少出现，确切的临床意义仍有待深入研究。aPLs低滴度阳性可见于生理性、暂时性、感染或病理状态，需结合患者临床表现，并定期检测随访。新型aPLs检测项目的相关临床意义仍有待在长期、前瞻性的研究及临床实践中深入探讨。
4.类风湿关节炎（RA）相关自身抗体检测的规范化［27］：RA相关自身抗体，根据抗原的特性主要包括类风湿因子（RF）、抗瓜氨酸类蛋白抗体（ACPA）及其他自身抗体，其中RF和ACPA已纳入RA的分类标准，主要用于RA筛查及诊断，同样在RA预后与治疗中起重要作用。
RA相关自身抗体的实验室检测，通常使用血清标本，RF以检测IgM型为主，ACPA以检测IgG型为主，针对不同的自身抗体可采用多种检测方法。RF、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体检测结果使用国际单位（IU），实验室应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证。每批次定性检测时，建议使用阴性和阳性质控品进行质控；定量检测时应至少选择两个水平的室内质控品，一般情况下选择质控品的浓度应包括正常值（参考区间内）和临床异常值。定性检测使用非参数的百分位数方法建立截止值，推荐采用 95 的百分位数（95%），大于截止值判断为阳性；定量检测以表观健康人群的血清标本建立参考区间，对试剂盒厂家的参考区间进行验证。定性检测结果报告应包括检测方法、检测结果（阴性/阳性）、滴度、参考值及必要的临床建议；定量检测结果报告中应包括检测方法、检测结果、单位、参考值及必要的临床建议。
RF、ACPA作为RA分类标准中的实验室指标，在RA早期诊断中具有重要意义，并可作为关节损害进展的预测因素，联合检测可提高RA诊断的敏感度。RF检测以IgM型为主，但不同亚型的检测具有不同的临床应用价值。对RA相关自身抗体进行定量检测，通常定量结果越高，临床意义越大。虽然RF、ACPA已有标准物质，但由于不同厂家试剂针对的抗原表位、抗原固定方法及检测技术等不同，不同厂家的检测结果有所差别。因此，对 RA患者病情监测时，建议选择同一厂家的定量检测试剂进行动态观察。RF、ACPA阳性亦可见于其他AID，阳性结果不能独立作为确诊的依据，而应根据相关临床诊治指南，结合患者关节炎的临床特点、影像学及实验室检测结果进行诊断。
5. AILD相关自身抗体检测的规范化［28］：包括自身免疫性肝炎（AIH）相关自身抗体、原发性胆汁性胆管炎（PBC）相关自身抗体及原发性硬化性胆管炎（PSC）相关自身抗体等。主要用于疾病的诊断与分类，亦有助于重叠综合征的诊断。对肝功能异常、未明原因的肝胆疾病患者，检测AILD相关自身抗体。自身抗体可在AILD患者出现典型临床症状前检测到，对相关疾病具有预测价值。
AILD相关自身抗体检测可采用以各种细胞、组织为实验基质的IIF，不同的自身抗体在不同的实验基质上呈现不同的荧光模型。IIF检测AILD相关自身抗体的准确性与试剂、设备、实验人员操作和结果判读等因素有关，应具有完善可靠的室内质控（包括阴性、阳性）和室间质评，确保实验检测结果的重复性与准确性。其他免疫学方法具有实验操作简单、快速、易自动化、定量或半定量检测的特点，但仅针对靶抗原明确的自身抗体，具有一定的局限性。另外，不同试剂若采用不同来源的靶抗原，将产生不同的临床诊断性能。
AILD相关自身抗体具有不同的临床意义，不仅存在于AILD患者中，亦可出现在AILD无症状者的临床前期，以及病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝癌及非肝脏疾病等患者中。另外，由于自身抗体滴度较低，检测试剂包被抗原、方法学的差异，存在诊断标准、分类标准以外的自身抗体等，故自身抗体阴性不能排除AILD。AILD相关自身抗体在儿童患者中，其滴度可与疾病活动性、疗效监测等存在一定的相关性，但在成人患者中不能作为上述的监测指标。在重叠综合征患者，随病情的进展逐渐出现AILD相关自身抗体。
总之，随着自身抗体检测的技术进步及其临床应用推广，为提高自身抗体的规范检测，确保检测结果的正确解读，减少不必要的重复检测，降低患者医疗费用，对自身抗体检测的临床应用规范化显得尤为迫切。目前，自身抗体的检测已不断规范化，但仍需将规范化的建议、共识不断更新及临床推广应用。
引用：周仁芳, 何敏, 杨滨, 等. 自身抗体检测的规范化及实践[J]. 中华内科杂志, 2023, 62(4): 356-362.
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