乙型肝炎病毒整合DNA在慢性乙型肝炎中的作用
乙型肝炎病毒整合DNA在慢性乙型肝炎中的作用
慢性乙型肝炎（CHB）是乙型肝炎病毒（HBV）持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。随着对HBV感染及其复制过程的深入研究，我们发现在HBV复制的过程中会合成一种双链线性DNA（double-strand linear DNA, dslDNA），这种dslDNA会与宿主基因组进行整合形成整合HBV DNA。这种整合HBV DNA的存在可能是CHB患者无法达到功能性治愈的原因之一。
整合HBV DNA对维持病毒持续复制有重要作用，它的存在也会进一步诱导肝细胞癌（HCC）的发生进而影响患者的预后。因此，本文对整合HBV DNA及其临床意义进行阐述，为改善CHB患者的预后提供新的治疗思路。
一、整合HBV DNA的合成
HBV颗粒中的前基因组RNA（pre-genomic RNA，pgRNA）作为模板，在HBV逆转录酶作用下，形成子代HBV DNA，对HBV在体内维持持续复制具有重要作用。但在逆转录形成子代DNA过程中，pgRNA也会形成dslDNA。与子代DNA-松弛环状的双链病毒DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）不同，这种dslDNA是双链线性的DNA片段，易整合在宿主的基因组中形成整合HBV DNA。
在感染HBV的肝细胞中，聚合酶（pol）与pgRNA的5'-epsilon（ε）区域结合形成P-ε核糖核蛋白（ribonnucleoprotein，RNP）复合物，作为引物经历3次跳跃后合成rcDNA。第1次跳跃：pgRNA 5'端的RNP易位到位于3'端的重复序列1（DR1）逆转录形成负链rcDNA。在负链rcDNA形成的同时，Pol水解pgRNA模板，其RNase H活性作用的位点落后于逆转录位点18核苷酸（nucleotide，nt）。逆转录结束时剩余的18 nt的RNA作为合成正链rcDNA的引物[1,2]。第2次跳跃：在90% HBV的核衣壳中18 nt RNA易位到重复序列2（DR2），诱导正链rcDNA的合成。第3次跳跃：正链rcDNA的合成起源于负链3′末端尾端，沿着负链模板从5'末端向3′末端的方向合成部分片段后，其3′游离末端从负链的5′末端转至3′末端。
然而，如果引物仅经历一次跳跃，则会形成dslDNA。在10%的HBV的核衣壳中，引物第2位发生易位，仍与DR1区域结合沿着负链合成正链rcDNA，形成双链线性DNA即dslDNA。dslDNA既可以通过同源重组恢复到共价闭合环状DNA（cccDNA），又可以产生子代dslDNA。合成的dslDNA既可以被运输到细胞核整合到宿主细胞基因组中维持病毒的持续复制与表达诱导HCC的发生，又可作为含有dslDNA的病毒粒子释放[3]。
二、整合HBV DNA的特点
1．整合HBV DNA的合成具有累积性：
整合HBV DNA不仅可以通过主动复制在正常肝脏的肝细胞内不断累积[4]。在患者体内某些细胞克隆中也存在克隆整合[5]，尤其在HBV相关HCC患者中更常见[4]。这说明了在肝细胞内整合HBV DNA至少存在两条协同方式使其不断地累积。
2．整合HBV DNA发生整合的位点具有特异性：
近年来的研究发现，dslDNA与宿主基因组进行整合的位点具有一定的特异性。多项研究证明HBV DNA更倾向于整合到基因组上基因富集区域，尤其是转录活跃的区域，这可能与转录活跃的区域会因解旋失去了核小体的保护而更容易损伤断裂有关。
dslDNA更易整合到癌症驱动基因中，TERT、KMT2B和CCNE1都是HBV基因组已知的热点整合位点[6]。这种HBV基因组片段的插入可能会诱导HCC的发生。与之相符，对比CHB中发生HCC与未发生HCC的患者，可观察到发生整合的频率与位点都有明显区别[7]。一方面，在CHB患者中，HCC患者存在更高水平的整合HBV DNA；另一方面，与非HCC患者整合位点分散分布相比，HCC患者会在特定基因组位点中表现出一定富集[5,6,8]，比如编码或启动子区域。这种在特异的位点发生整合的现象也揭示着整合HBV DNA与HCC的发生密切相关。整合HBV DNA发生整合位点的特异性不仅仅表现在于对于宿主的整合位点具有特异性，其对于病毒的整合位点也具有一定的特异性，dslDNA的整合位点40%位于病毒的增强子、X基因和核心基因。
3．整合HBV DNA的表达具有选择性：
与rcDNA不同，整合HBV DNA仅能表达部分病毒蛋白。HBsAg是整合HBV DNA唯一能完整表达的病毒蛋白[9]；HBeAg / HBcAg因为启动子与开放阅读框（open reading frames, ORFs）分离难以表达[10]；HBV X基因（HBx）在增强子1的作用下虽然能表达[11,12]，但其末端片段会被一定程度的截断[13,14]。
研究发现尽管患者处于低病毒血症阶段，但在肝脏组织中仍广泛检测到HBsAg的存在[9]。另有研究通过RNA测序等技术证实了在许多CHB患者中存在具有HBsAg表达的嵌合转录本[9]。最直接的证据则是Robin Erken在肝组织中直接检测出来自整合HBV DNA的ORFs[15]。然而，目前的口服抗病毒治疗药物主要是针对抑制rcDNA逆转录过程而研制的核苷（酸）类似物，并不能有效抑制整合HBV DNA表达的HBsAg。因此，在临床诊疗过程中可以发现，患者尽管长期规律地使用核苷（酸）类似物，但仍然不能有效降低HBsAg。这或许也可以解释在临床诊疗中，CHB患者中存在HBV DNA低水平，而HBsAg高水平的现象。
在整合HBV DNA中，HBx可在增强子1作用下表达，但其末端常被截断。部分HBx C端截断的突变体仍可具有转录反式激活的作用，这取决于截断突变的位置[12,13]。HBx C端截断的突变体因缺乏终止密码子，故而可以产生HBV细胞融合转录本[1]，诱导HCC的发生。此外，HBx C端截断的突变体的过表达，会产生类似干细胞样的功能。一方面可通过控制细胞增殖、活力和转化[16]诱导HCC的发生，另一方面，也会增强HCC的细胞侵袭性和转移能力[17]。
综上所述，整合HBV DNA可以表达出难以清除的HBsAg及诱发HCC的HBx突变体。因此整合HBV DNA的存在是无法实现功能性治愈甚至导致不良预后的原因之一。
4．整合HBV DNA的重排具有恶性倾向：
在HBV基因组内可存在多个重排和缺失[12]，整合HBV DNA相关结构的重排可通过改变远处的基因来影响癌症驱动基因继而诱导恶性肿瘤发生[4]。例如整合HBV DNA经常诱导chr8q和chr5p等具有抑癌潜力的基因上调以及chr17p等具有致癌潜力的基因下调[4,6]。此外，着丝粒或端粒区域是维持基因稳定及持续复制的重要区域，整合HBV DNA在此处影响染色体的稳定性进而诱导HCC的发生。
三、整合HBV DNA的临床意义
（一）整合HBV DNA维持病毒的复制及慢性炎症
大多数研究者认为HBV DNA整合发生在感染早期，如William S Mason发现年轻的免疫耐受时期的CHB患者存在高水平的HBV DNA整合，证明了在HBV感染的早期便存在整合HBV DNA[7]。这种在病程早期即会发生整合的现象间接表明HBV DNA整合可能参与HBV复制和持续感染。此外，最新的研究发现整合HBV DNA水平与血浆HBV DNA、HBsAg水平及炎症相关，但与纤维化和脂肪变性程度不相关[15]。这项研究进一步证实整合HBV DNA可能参与HBV的复制，维持慢性炎症状态。整合HBV DNA的独特的结构与表达或许对维持病毒的复制及慢性炎症具有重要意义。dslDNA不仅可以通过表达病毒相关蛋白来维持复制；也可以通过同源重组恢复到野生型cccDNA直接作为病毒复制的模板[3]。一方面，整合HBV DNA可以合成HBsAg来维持持久的抗原性诱导慢性肝脏炎症，也可以表达HBsAg的突变型通过调节HBV转录来逃避免疫反应，使之得以持续复制。另一方面，整合HBV DNA可以通过表达HBx蛋白进而诱导Smc5/6转录抑制因子复合物发生泛素化来激活HBV cccDNA的转录。此外，整合HBV DNA表达的HBx缺失部分片段，导致在现阶段研究的新型靶向药物缺失作用的靶点[18]。所以即便在低病毒载量患者中，整合HBV DNA仍会普遍表达[9]，维持病毒的复制及肝脏慢性炎症。
以上多项研究与临床现象表明整合HBV DNA参与维持HBV的复制与持续感染。在未来的研究中，整合HBV DNA相关位点或其表达的蛋白特异位点或许是治疗CHB患者的一种新型靶点。
（二）整合HBV DNA可诱导无肝硬化背景的CHB患者发生HCC
整合HBV DNA作为诱导HCC发生的独立因素，通过DNA片段的插入改变HCC相关基因的活性，影响基因组和染色体的稳定性和表达具有致癌潜力的HBV蛋白诱导HCC的发生，进而影响患者预后。然而与通过经典的慢性炎症进展到纤维化进而并发HCC不同，部分CHB患者由于整合HBV DNA的存在可不经过慢性的肝脏炎症、纤维化/肝硬化直接诱发HCC发生。有研究通过对肝活检可观察到HBV ORF X/S整合的相对水平与纤维化不相关[14,15]。在另一项对隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection ，OBI）的HCC患者进行肝活检的研究中[19]，可观察到存在整合HBV DNA的90% HCC患者没有发生肝硬化，进一步说明HBV所致非肝硬化背景的HCC与整合HBV DNA密切相关。此外，在无肝硬化基础的HCC患者的肝组织中发现了整合HBV DNA作用的癌基因[20,21]，这些基因的激活或失活可能有助于HCC的早期发生，而不会造成肝硬化反应。
因此，整合HBV DNA的存在可诱导无肝硬化基础的CHB患者发生HCC，进而影响患者预后[4,20]。所以对丙氨酸转氨酶无显著升高且炎症和/或肝纤维化程度未达到现行治疗标准的患者开展抗病毒治疗，可能会有助于预防HCC的发生。此外，通过研究频发的整合位点来揭示导致肝细胞克隆扩增的特定驱动基因，或是利用整合DNA表达的蛋白作为靶点均可能提高患者的生存率。
（三）整合HBV DNA对临床诊疗具有指示意义
1．整合HBV DNA在OBI期指导预后：
OBI的特点是血清中检测不到HBsAg表达水平，但可以在血清或肝细胞中检测到低水平的HBV DNA[19]。对OBI阶段HCC患者的肝组织活检结果进行分析，可以观察到整合HBV DNA（69%）较cccDNA（47%）更常见[19]。对于处在OBI阶段的患者，相比于cccDNA，整合HBV DNA的水平高低对预测HCC的发生更具有意义。同时，在OBI患者中，无肝硬化基础的HCC患者可检测到高水平的整合HBV DNA[19]。这表明OBI患者发生HCC的过程中，整合HBV DNA的存在可能比长期的肝脏炎症损伤起到更重要的作用。
2．整合HBV DNA在免疫耐受期指导治疗：
免疫耐受期的特点是肝脏低炎症反应及HBV DNA高水平复制。基于免疫耐受缺乏判断疾病进展的标志及抗病毒免疫低下的特点，也基于药物不良反应以及长期治疗依从性的考虑，中国最新的CHB防治指南并没有明确提出针对这个时期的患者是否启动治疗[22]。然而仅靠血清学检测无法全面反映肝脏炎症情况，越来越多的专家也建议对此阶段的患者进行积极的抗病毒治疗。与此同时，Mason等[7]提出在免疫耐受阶段也可以检测到高水平的整合HBV DNA。结合免疫耐受阶段高水平的整合HBV DNA及其与HCC之间的密切关系为积极治疗该阶段的患者和改善CHB患者预后提供了新的依据[8]。
3．整合HBV DNA可预测功能性治愈：
整合HBV DNA与病毒复制之间相互促进的关系预示着二者可以作为互相预测的指标。高水平的HBsAg（>5 000 IU/ml）可以预测HBeAg阴性患者HBV DNA整合事件的发生[23]。而对CHB患者进行为期5年的随访，可发现整合HBV DNA的水平也是HBsAg丢失的独立预测因子[15]。HBsAg是诱导功能性治愈的重要靶标，而整合HBV DNA与HBsAg水平正相关，也进一步证明HBV DNA整合可能直接或间接影响功能性治愈。因此，无论是在监测病情变化中还是在研发治愈CHB的新型治疗方式中均应考虑整合HBV DNA水平的影响。
四、总结与展望
综上所述，在CHB各个阶段，整合HBV DNA都存在高水平的表达。整合HBV DNA不仅可以参与HBV的复制、维持慢性炎症及诱导HCC的发生，同时整合HBV DNA水平也可以预测HBsAg的消失。而现有的抗病毒治疗方案并不能作用于整合HBV DNA，这或许是CHB患者即便经过长期规律的抗病毒治疗，仍难以达到功能性治愈的原因之一。因此，更加深入地了解整合HBV DNA，将对于干预CHB患者预后和研发更有效的治疗措施具有重要的意义。
引用：陈媛美,刘锦,朱传武,等.乙型肝炎病毒整合DNA在慢性乙型肝炎中的作用研究进展[J].中华肝脏病杂志, 2024, 32(2): 164-167.
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