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支气管肺泡灌洗液对肺结节鉴别诊断的临床意义

临床大师 离床医学
2024-08-28

支气管肺泡灌洗液对肺结节鉴别诊断的临床意义

肺癌是我国发病率及病死率均位于第一的恶性肿瘤1]。目前,肺癌的五年生存率约为22%,其中晚期肺癌五年生存率仅为6%,而早期肺癌五年生存率高达60%1]。因此,肺癌早期诊断是改善其预后的关键。通过胸部影像学筛查肺部结节是早期发现肺癌的基本途径,目前对肺结节的性质判定主要基于肺结节的形态特征和动态观察。近年来,液态活检凭借其无/低创性、高灵敏度、易于动态观察等优势在肿瘤的早期诊断、疗效监测等方面展现出巨大潜力,受到广泛关注。

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一、肺癌早期诊断现状及存在问题

目前,通过影像学,尤其是低剂量CT(low dose CT,LDCT)的定期检查早期发现肺结节是最为重要的措施。研究显示LDCT检查可以降低肺癌的病死率,但仍存在一定的问题。
1. 肺结节非必须手术比例较高。多个国家/地区的研究统计显示,胸部CT肺结节的检出率为20%~70%,其中结节为恶性的比例为0.3%-6.3%2, 3, 4, 5, 6, 7]表1)。

2. 动态观察造成辐射暴露增加8, 9]。荟萃分析显示,因CT检查发现肺结节需要后续CT检查的比例为1%~44.6%9]。意大利持续观察吸烟受试者肺癌早期检测试验研究数据的二次分析表明9],每173例筛查发现的肺癌中有1例与辐射暴露相关,每108例筛查发现的肺癌中有1例出现辐射暴露相关的其他器官肿瘤(胃癌、肝癌、乳腺癌等)。
3. CT检查后需要动态随访造成焦虑和恐惧10, 11]。对NELSON研究入组中部分患者(351例)所进行的研究显示,46%的患者在等待CT检查结果期间出现了焦虑,51.3%的患者对于CT检查结果产生了恐惧10]
综上,如何对影像学发现的肺结节进行更为准确的性质判定,是需要关注和亟待解决的问题。临床医生和相关领域研究者通力合作、联合研发针对肺结节性质的精准检查方法和技术就显得非常重要,将有助于提高诊疗效能、改善预后、避免非必须手术、减轻经济负担,并减少医疗资源占用6,12]
肺癌确诊主要依靠组织病理学及细胞病理学检查,肺癌液态活检通过对肺部病变部位的液体样本中的细胞、分子标志物及游离DNA等进行检测,从而协助判断肺部病变的性质。主要标本来源包括BALF、痰液、胸腔积液、血液等。其中,支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL)被称为“液性肺活检”,因其具有以下优势而受到关注:(1)定位准确:目前的技术支持CT影像指导下的段、亚段乃至更为精准部位的灌洗,并且可进行多个部位的灌洗;(2)搜集信息丰富:BALF中除脱落的肿瘤细胞外,还含有肿瘤细胞合成并分泌到病变部位处支气管腔和肺泡腔内的,多种可供检测的与肺癌诊断相关的物质;(3)可及性强:BAL属于支气管镜的基本检查技术,易普及。因此,BALF液态活检可在细胞层面需要特定方法高效俘获脱落的痕量肿瘤细胞,并通过多种后续技术进行确认,如形态学等;在分子层面可进行DNA甲基化和脱落细胞基因测序的检测;在生化方面可进行肺癌肿瘤标志物的检查;在细胞和分子遗传学方面可进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和染色体倍体分析等,将这些检测手段联合进行多模态分析,有望进一步提高诊断效能。早在20世纪40年代液性肺活检即作为癌症早期诊断的方法被提出13],然而基于传统涂片、离心/沉降等技术从液体中分离/检测痕量细胞的方法由于敏感度较低,在临床实践中逐渐被放弃。近年来,随着微纳米技术的发展及其在单细胞水平操作能力的优势,液体中痕量细胞分离/检测的敏感度得到了很大提升,同时,BALF中与肺癌相关的其他指标的检测也有诸多进展,使得液态活检再次受到关注,并有望通过临床试验实现转化和应用14, 15, 16, 17]

二、基于BALF液态活检的诊断技术进展

1. 细胞学检查:传统的BALF细胞学检查是通过离心、沉淀或甩片等方法收集脱落细胞,并进行巴氏染色、HE染色、吉姆萨染色等。根据文献报道18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]进行的荟萃分析显示BALF细胞学检查对肺癌诊断的合并敏感度为48%(95%CI:32%~64%),合并特异度为99%(95%CI:96%~100%),见图1

BALF细胞学检查对肺癌的诊断敏感度受以下因素影响:(1)病变位置和大小。(2)样本的差异性。假阴性结果的产生主要与病变合并炎症相关,其他原因包括取材缺少代表性、细胞成分过少等28,33]。(3)样本处理方法。直接涂片常导致红细胞、炎性渗出物和黏液混杂,背景不清晰,影响病理医生阅片及诊断结论;纱布过滤虽可在一定程度上去除黏液,但非特异性吸附容易造成肿瘤细胞(团)的丢失从而影响敏感度29]。BALF细胞学检查的样本制备方法(痕量脱落肿瘤细胞的分离或回收)优化可提升诊断的准确性。因此,BALF细胞学检查的高敏感度依赖于标准化的样本预处理流程和痕量脱落肿瘤细胞的高效分离富集,后续研究应重点关注和提升这两方面。
2. DNA甲基化:DNA甲基化是一种生化修饰,可通过沉默基因表达和维持基因组稳定性来避免出现错误重组事件及附近基因转录失调34]。异常的DNA甲基化可导致抑癌基因沉默或致癌基因激活,这些改变是肿瘤发生的早期事件之一34]。在肺癌患者外周血中可检测到多种异常的DNA甲基化,如SHOX2、PTGER4、RASSF1A、NID2等,其对肺癌诊断的敏感度为39.6%~87.0%,特异度为71.4%~98.0%26,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44]。外周血甲基化检测为肺癌诊断提供了重要信息,但其对早期肺癌诊断敏感度低38],且诊断敏感度高低与病理类型相关42]。因此,外周血甲基化检测距离实现肺癌的早期精准诊断还有一定的差距。
根据文献报道20, 21,24,26,43, 44, 45, 46, 47, 48]进行的荟萃分析得到的BALF甲基化检测对肺癌诊断的合并敏感度为76%(95%CI:64%~85%),合并特异度为89%(95%CI:84%~93%),见图2。基于BALF甲基化检测的肺癌诊断具有以下优势:(1)较细胞学检查(TCT)敏感度高,在早期肺癌中的高灵敏诊断优势更明显。(2)高于外周血甲基化检测对肺癌诊断的敏感度。然而,同外周血甲基化检测一样,BALF甲基化检测也存在着诊断敏感度受组织病理类型影响的局限性26]。后续研究需要开发新方法实现临床BALF样品中复杂背景下低丰度游离DNA的分离富集、进而提高甲基化检测的敏感度,重点关注并解决多个甲基化位点检测对不同类型肺癌的适用性。

3. 脱落细胞基因测序:随着靶向治疗的发展,与肺癌发生/进展相关的信号通路逐渐被关注,如EGFR、BRAF基因突变,KRAS、ALK基因重排等。既往认为细胞学检查所获取的样本含有的细胞/DNA数量有限,不足以进行基因分析,但近期的研究表明相对低含量的细胞仍是可以实现相关基因的检出的,且肿瘤细胞基因测序技术已在多种样本的检测中得到应用49, 50, 51, 52, 53, 54],包括超声内镜引导下的经支气管针吸活检(endobronchial ultrasound and transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA)51, 52]、支气管镜刷检样本53]、胸腔积液54]。然而,基于BALF样本中脱落细胞基因测序对肺癌诊断的相关研究相对较少。Buttitta等55]研究发现,直接涂片+巴氏染色法基于形态学检测BALF中脱落肿瘤细胞的敏感度较低,而基于NGS对涂片所得脱落细胞的DNA测序对肺癌诊断的敏感度高,特异度有待进一步探究。后续研究中值得关注的是:(1)开发新技术提高脱落肿瘤细胞分离/富集效率及检出敏感度,进而提高脱落肿瘤细胞基因测序效率;(2)提高游离DNA的高效预分离/富集效率以提高NGS检测的敏感度和特异度;(3)对同一份BALF样本中脱落肿瘤细胞提取的总基因组DNA(gDNA)和上清中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)并行测序分析,联合应用以综合提升肺癌的诊断效果。
4. 肿瘤标志物:
肿瘤标志物是在恶性肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身所产生的或是由机体对肿瘤细胞反应而异常产生和(或)升高的,反映肿瘤存在和生长的一类物质,包括蛋白质、激素、酶(同工酶)、多胺及癌基因产物等31]。临床常用的肺癌肿瘤标志物包括:癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、细胞角蛋白片段19(cytokeratin fragment 19,CYFRA 21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC)及胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP)等。BALF中肿瘤标志物检测对肺癌诊断的敏感度为13.0%~72.9%,特异度为69.2%~95.0%32,56]。从目前研究结果32,56]来看,目前的肺癌肿瘤标志物检测对肺癌诊断的敏感度和特异度较低,利用新方法筛选新型生物标志物、与细胞层面结果多模态联合对诊断效果进行提升值得关注。近年来,BALF中的部分新型肿瘤标志物,如膜联蛋白57],具有蛋白浓度高58]、有助于区分肺癌类型59]等优势,对肺癌具有一定的潜在诊断价值。
5. 染色体倍体分析:
当细胞发生癌变时,基因会发生多种变化,导致DNA非整倍体的出现。DNA非整倍体是恶性肿瘤的标志之一,可以应用细胞图像测量术(image cytometry,ICM)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)对细胞DNA含量和倍体进行分析。DNA-ICM通过测定细胞核DNA的集成光密度(integrated optical density,IOD)反映DNA含量,计算得到的DNA指数(DNA index,DI)可用于协助肿瘤的诊断。DNA-ICM检查结果分为以下3类:(1)阴性:无明显异倍体细胞及异倍体细胞峰;(2)怀疑恶性:可见少量DNA倍体异常细胞(1~2个细胞DI≥2.5)或细胞异常增生(≥10%);(3)高度怀疑恶性:可见大量DNA倍体异常细胞(≥3个细胞DI≥2.5)及异倍体细胞峰19,22]。DNA-ICM检查结果的诊断阈值受到组织类型、样本种类的影响,而BALF染色体倍体分析的诊断阈值尚未标准化,这可能导致误诊/漏诊。另外,DNA-ICM只能判断细胞的异常,而不能识别异常细胞的肿瘤分型。DNA-FCM利用流式细胞术进行DNA倍体含量测定,以发现非整倍体为判断恶性肿瘤的标准。根据文献报道19,22, 23,25,60, 61]进行的荟萃分析得到的染色体倍型分析(DNA-ICM/DNA-FCM)对肺癌诊断的汇总敏感度为77%(68%~85%),汇总特异度为97%(79%~100%)(图3)。假阴性结果的原因可能为:肿瘤细胞染色体在复制和丢失之间保持平衡,或二倍体细胞数量高于异倍体细胞数量;假阳性结果可能与少数炎性细胞的退变或核固缩有关,这些情况下可能出现异倍体细胞。Yoss等60]的研究表明染色体倍体分析对肺癌诊断的敏感度高于传统细胞学检查(58% vs 38%),二者联合分析对肺癌诊断的敏感度可提高至85%。综上,DNA-ICM和DNA-FCM检查快速、客观、准确,可作为肺癌早期诊断的方法,联合细胞形态学检查等方法可使其应用效果得到进一步提升。
6. 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH):
FISH是一种使用荧光标记的DNA探针检测细胞中染色体数目和结构畸变的标准方法,可检测各种类型的细胞遗传学改变,包括染色体异常、重复、扩增、缺失和易位,适用于几乎所有类型的细胞学标本62]。FISH探针有2种类型:染色体计数探针(chromosome enumeration probes,CEP)和位点特异性标识分子探针(locus-specific indicator probes,LSI),CEP探针用于检测染色体异常,LSI探针通常用于检测特定基因的缺失、重复或扩增62]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)指南推荐使用FISH进行检测的项目包括:ALK、ROS1、RET基因重排及MET、HER2基因扩增等63],这些检测项目已被纳入NSCLC的诊断标准,相应的激酶抑制剂也已在临床上常规使用。BALF中脱落细胞的FISH检测对肺癌诊断的敏感度在75.0%~84.3%,特异度在82.1%~100.0%64, 65]。进一步提高BALF中FISH检测对肺癌诊断的敏感度与特异度可从以下两方面考虑:(1)提高BALF中脱落肿瘤细胞的分离/富集率,从而提高FISH的检测敏感度;(2)结合NGS、IHC等方法多对不同的肺癌相关分子进行检测分析以减少假阳性结果,提高临床诊断的特异度。

三、总结与展望

基于BALF的液态活检可从细胞、分子、生化及遗传学多个层面进行检测分析,既能弥补细胞病理学敏感度低的不足,又能克服特定情况下组织病理学标本取材不足或获取困难的问题。对于影像学检查难以确定性质的肺结节,基于BALF的液态活检所提供的病变信息可以作为影像学检查的重要补充,有助于实现肺结节性质的早期鉴别,优化肺结节的早期诊断流程,同时减少辐射暴露、降低患者心理负担,提高肺癌的诊断效能,进而改善预后。在后续的研究中,相关技术的开发和优化主要包括:(1)BALF样本的预处理;(2)BALF中痕量脱落肿瘤细胞、游离分子标志物、DNA的高效分离与富集;(3)通过建立多模态诊断策略,推进肺结节性质鉴别的精准化水平。

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TBI患者机械通气:现有证据和临床建议

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气管切开非机械通气患者气道管理

机械通气临床应用指南(PPT课件)

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无创呼吸机BiPAP V60的使用操作 | 高清视频

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经鼻高流量氧疗切换无创呼吸机时机(文图+视频)

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肝肺穿刺

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支气管内超声引导经支气管针吸在肺癌应用相关共识

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重症超声
对肺脏超声评分系统的思考
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颈部血管超声、经颅脑实质超声和周围神经超声的操作规范
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超声心动图正常值(超全汇总)
中国成人心脏瓣膜病超声心动图规范化检查专家共识2021
为何肺超声检查总是失败?(译文)
重症肺部超声的15个基本征象(图示)
重症超声临床应用技术规范
肺超声检查如此简单:分步指南
超声引导下胸腔穿刺置管术(NEJM视频)
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肺部超声评估胸腔积液(译文)
重症超声在心肺复苏中的临床应用
床旁超声在心脏骤停中的应用
床旁超声在急危重症临床应用的专家共识
POC:急诊超声的临床应用
床旁超声评估机械通气患者撤机风险
基于循证的成人床旁超声护理专家共识
用事实说话:床旁超声对急性心力衰竭的诊断及治疗
从超声心动图9大征象洞察肺动脉栓塞
如何利用超声心动图判断肺动脉栓塞?
超声引导桡动脉穿刺置管术(平面内)
超声引导下的锁骨下深静脉置管术(视频2个)
临床问题:深静脉导管拔管前,是否需要超声检查?
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重症超声引导的血管置管精准操作
重症超声指导循环衰竭处理临床思维
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肝病超声诊断指南2021
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